Влияние способов консервации и хранения на функциональную активность и состав микробиома биологически активного препарата БАГС

Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Работы были проведены за счет финансовой поддержки гранта РНФ 23-16-00147.

В микробиологической практике для сохранности микроорганизмов, имеющих важное научное или практическое значение, применяют разнообразные способы. При непродолжительном хранении, например, осуществляют периодические пересевы на свежие питательные среды, хранение под минеральным маслом, простое высушивание или замораживание при -10...-20 °С и т.д. (1, 2), при длительном — криоконсервацию (хранение при температуре -70.-196 °С) и лиофилизацию (3-5). Эти методы разрабатывались в основном для чистых монокультур. Главное требование к ним — сохранение чистоты, жизнеспособности и основных свойств микроорганизмов. При этом для разных видов и даже штаммов подбирается свой, наиболее эффективный способ, отвечающий этим требованиям (6). Для продления сроков хранения биопрепаратов, приготавливаемых, как правило, на основе одного или нескольких чистых коллекционных штаммов, применяют консервирующие вещества (для жидкой формы) и хранение в низкотемпературных условиях (7).

Не менее интересен с научной и практической точки зрения вопрос о возможности консервации сложных консорциумов (8, 9) на основе мобилизованных из природной среды микроорганизмов с сохранением свойств, обеспечивающих эффективность при практическом использовании. В литературе подобных работ немного (9-11).

Для ответа на этот вопрос в качестве модели был взят биологически активный препарат на твердофазной основе (БАГС), созданный несколько десятилетий назад и поддерживаемый в лабораторных условиях посредством периодических приготовлений. Зрелый БАГС, получаемый при компостировании торфо-минерально-соломистой смеси, содержит сложный многофункциональный микробный консорциум, обладающий целлюлозолитической, антифунгальной активностью, способный к деструкции ряда гербицидов (12-14). С применением методов высокопроизводительного секвенирования изучена таксономическая структура препарата (15).

Чтобы поддерживать БАГС, требуется постоянная, последовательная серия возобновлений (генераций) с использованием в качестве иноку-люма свежего препарата предыдущего приготовления. Возник вопрос, можно ли законсервировать свежеприготовленный препарат с сохранением целлюлозолитической активности после реконсервации и использования его как маточной культуры (инокулюма) для приготовления препарата по мере необходимости.

В настоящей работе впервые получены данные о возможности консервации стоковых образцов микробного препарата БАГС.

Цель работы — испытать различные способы хранения и консервации препарата БАГС, оценить их влияние на целлюлозолитическую активность и таксономический состав прокариотического компонента консорциумов с использованием метода глубокого секвенирования ампликонных библиотек гена 16S рРНК.

Методика. Работу проводили в 2023-2024 годах во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии. Объектами исследования были: исходный зрелый микробный препарат БАГС (первая генерация), полученный в результате компостирования в течение 6 мес торфо-соломистоминеральной смеси и инокулюма (БАГС предыдущего приготовления) по методике, описанной ранее (15); реактивированные образцы БАГС после хранения разными способами в течение 6 мес; экспериментальные партии БАГС, полученные при компостировании торфо-соломисто-минеральной смеси с использованием в качестве инокулюма реактивированных после консервации образцов препарата.

Испытывали три способа хранения и консервации образцов исходного БАГС: хранение свежего препарата в холодильной камере 450К-R (ОАО КЗХ «Бирюса», Россия) при низкой плюсовой температуре (+4 °C); высушивание при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния; криоконсервация. При подготовке образца исходного БАГС для криоконсервации в него в качестве криопротектора микробных клеток добавляли стерильный водный раствор глицерина (16) до конечной концентрации 15 % к массе, учитывая влажность препарата при расчетах, и помещали в морозильную камеру («SANYO Electric Co., Ltd.», Япония) при -60 °C. Спустя полгода хранившиеся в разных условиях образцы реактивировали, выдерживая при комнатной температуре в течение 1 нед, при этом предварительно высушенный увлажнили водой до влажности исходного препарата (60 % от полной влагоемкости).

Далее реактивированные образцы использовали для инокуляции торфо-соломисто-минеральной смеси при приготовлении экспериментальных партий БАГС. Для получения контрольной партии БАГС (3-я генерация) в качестве инокулюма брали свежий препарат 2-й генерации, который приготавливали по стандартной методике одновременно с хранением экспериментальных образцов. Все партии БАГС (4 варианта) инкубировали в пластиковых емкостях при 28 °С в течение 5 мес.

В динамике ежемесячно двумя способами оценивали целлюлозолитическую активность. При первом способе актуальную целлюлозолитическую активность определяли модифицированным методом Кристенсена (17). Навеску образцов каждого варианта в количестве 10, 20 или 30 г (в зависимости от диаметра чашки) помещали в чашку Петри, увлажняли водой до 60 % от полной влагоемкости и накладывали сверху бумажный обеззоленный фильтр («черная лента»). Наряду с актуальной оценивали потенциальную целлюлозолитическую активность. Для этого активировали целлюлозолитиков посредством обработки фильтров минеральным азотом в виде среды Гетчинсона из расчета 2 мл/10 г образца (0,8 мг N). Чашки инкубировали в термостате (INE 600, «Memmert GmbH + Co. KG», Германия) при 30 °С в течение 1-2 мес. Об эффективности судили по степени разложения бумажного фильтра. При втором способе потенциальную активность консорциума определяли аппликационным методом: навески воздушно-сухой мелко измельченной соломы (2 г) расфасовывали в нейлоновые мешочки, замачивали в растворе минеральных солей и помещали в компостируемую смесь. Через 1 мес их вынимали, промывали проточной водой, высушивали и взвешивали. Об эффективности судили по убыли тестовой соломы.

Микробиологический анализ сообществ проводили с использованием метода глубокого секвенирования ампликонных библиотек гена 16S рРНК. Анализировали три варианта экспериментальных партий препарата и контрольный БАГС 3-й генерации. ДНК выделяли в 4-кратной повторности из навесок по 0,5 г при помощи набора NucleoSpin Soil Kit («Mach-erey-Nagel GmbH & Co. KG», Германия) согласно протоколу производителя. Качество ДНК определяли электрофоретически, концентрацию — флуо-риметрически с использованием прибора Qubit fluorimeter («Invitrogen», США). Ампликонные библиотеки получали с парами праймеров f515 5´-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3´/r806 5´-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3´ (18) для участков прокариотических генов 16S рРНК при помощи ПЦР на приборе T100 Thermal Cycler («Bio-Rad Laboratories», США) по следующему стандартному протоколу (https://support.illumina.com/documents/documentati-on/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223- b.pdf). Режим амплификации: 3 мин при 95 °C; 30 с при 95 °C, 30 с при 55 °C, 30 с при 72 °C (25 циклов); 5 мин при 72 °C. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов (секвенатор Illumina MiSeq, «Illumina, Inc.», США) определяли согласно стандартному протоколу производителя. Анализ прочтений осуществляли с использованием пакетов dada2 (v1.14.1) (17), phyloseq (v1.30.0) (20) в программной среде R (v.4.2.0). Основными этапами обработки были фильтрация по качеству, формирование вариантов ампликон-сиквенсов (amplicon sequence variants, ASVs), таксономическая аннотация, удаление химерных последовательностей. При таксономической аннотации в качестве референсных использовали базы SILVA (v.138.1) (21) для последовательностей гена 16S рРНК.

Количественное сравнение микробиомов проводили по показателям альфа- (внутри выборки) и бета-разнообразия (между выборками). Для расчета индексов альфа-разнообразия ампликонные библиотеки были нормализованы методом разрежения по минимальному размеру. Оценка альфа-разнообразия включала определение общего числа ASVs и обратного индекса Симпсона. Визуализацию бета-разнообразия проводили методом неметрического многомерного шкалирования (non-metric multidimensional scaling, NMDS) по метрике Брея-Кертиса. Для расчета индексов разнообразия и визуализации данных использовали пакеты vegan (2.6.8) (23), phyloseq (1.44.0) и tidyverse (2.0.0 (24). Для оценки достоверности различий между микробиомами по альфа-разнообразию применяли дисперсионный анализ с тестом Тьюки в составе пакета rstatix (0.7.2) (25). Различия между образцами определяли в пакете ANCOM-BC2 (26).

Результаты . На рисунке 1 представлена схема последовательных этапов эксперимента, включающих подготовку и 6-месячное хранение образцов БАГС разными способами, их реактивацию в течение 1 нед и использование для инокуляции торфо-минерально-соломистой смеси, далее — 5месячную инкубацию и получение экспериментальных партий препарата.

Рис. 1. Схема эксперимента по оценке влияния способа хранения на эффективность и таксономический состав БАГС: 1 — исходный свежий препарат; А — образцы, хранившиеся полгода: высушенный (2), свежий при +4 ° С (3), свежий при - 60 ° С (криоконсервация с 15 % глицерина) (4); Б — реактивированные образцы после высушивания (5), хранения при +4 ° С (6), криоконсервации (7); 8 — вторая генерация свежего (стандартного) препарата; В — экспериментальные партии 5-месячных препаратов с реактивированными инокулюмами после высушивания (9), хранения при +4 ° С (10), криоконсервации (11); 12 (контроль) — третья генерация свежего (стандартного) препарата. Звездочкой отмечены образцы, взятые на исследование целлюлозолитической активности и таксономического состава прокариотического компонента консорциумов.

При приготовлении последних через 2 нед от начала инкубации в варианте с инокулюмом (криоконсервация) на поверхности компостируемой смеси появились плесневые грибы серого цвета, исчезнувшие через 1 мес. Актуальная целлюлозолитическая активность этой партии БАГС (на основании теста по степени разложения бумажного фильтра) была низкой (не выше 10-20 %) во все сроки анализа на протяжении 5 мес приготовления (табл.).

Динамика целлюлозолитической активности партий препарата БАГС, приготовленных с реактивированными инокулюмами, для хранения которых использовали различные способы (модифицированный метод Кристенсена) (лабораторный опыт)

Степень разложения бумажного фильтра, %

Способ хранения образцов БАГС 1 мес инкубации 3 мес инкубации 5 мес инкубации А П А П А П Свежеприготовленный (контроль) 100 100 100 100 100 100 Хранение при +4 °С 100 100 100 100 10 100 Высушивание при +20 °С 100 100 100 100 100 100 Хранение при -60 °C (криоконсерва- 20 40 10 95 10 100 ция с 15 % глицерина)

Примечание. А — актуальная активность, П — потенциальная активность.

Учитывая, что при разложении соломы целлюлозолитические микроорганизмы активно потребляют азот, необходимый им для синтеза белков, ферментов и других клеточных компонентов, которые участвуют в разложении целлюлозы, и при его недостаточном количестве в субстрате их активность может быть значительно снижена, мы оценили потенциаль- ную активность целлюлозолитиков с дополнительным внесением азота в пробу препарата в тесте с бумажным фильтром.

В варианте с криоконсервацией через 1 мес показатель составлял 40 %, но к концу инкубации значительно вырос и через 5 мес достиг максимума (100 %). Напротив, в двух других экспериментальных партиях БАГС с инокуляцией реактивированными образцами после хранения при +4 °С и после высушивания, а также в контрольном БАГС была выявлена высокая актуальная и потенциальная целлюлозолитическая активность во все сроки анализа.

Эти результаты почти полностью коррелировали с данными второго теста по оценке убыли тестовой соломы (рис. 2).

Рис. 2. Динамика целлюлозолитической активности партий препарата БАГС, приготовленных с реактивированными инокулюмами, для хранения которых использовали различные способы (аппликационный метод, основанный на оценке убыли тестовой соломы): а — свежий БАГС (контроль), б — хранение при +4 ° С, в — хранение при - 60 ° C (криоконсервация с 15 % глицерина), г — высушивание при +20 ° С ( n = 4, M±SD; лабораторный опыт).

Высокая активность наблюдалась в вариантах с высушиванием и хранением при +4 °С, в отличие от криоконсервации. В последнем случае наибольшее торможение убыли соломы (на 60 % меньше контроля) было отмечено через 1 мес, но в зрелом 5-месячном препарате целлюлозолитическая активность возросла и даже превысила контрольный вариант на 15 %. Следует отметить, что при приготовлении трех партий БАГС, вклю- чая контрольную и варианты с инокулюмами после высушивания и хранения при +4 °С, происходило активное разложение соломы как компонента компостируемой смеси. Она практически не обнаруживалась уже через 3 мес, в то время как в варианте с криоконсервацией такая степень разложения была достигнута на 1 мес позже.

Наряду с оценкой возможности применения образцов БАГС, для хранения которых использовались различные способы, при получении препаратов с высокой потенциальной целлюлозолитической активностью, мы провели сравнительный анализ таксономического состава микробных сообществ зрелых партий БАГС.

Для оценки биоразнообразия микробиомов были рассчитаны индексы разнообразия (математическая мера разнообразия видов в сообществе, основанная на видовом богатстве, или количестве выявленных видов, и видовом обилии, или числе представителей каждого вида). Показатели обратного индекса Симпсона описывают разнообразие сообщества, учитывая как видовое богатство, так и равномерность распределения по видам: чем выше его значение, тем больше разнообразие. Он также может указывать на доминирование по численности тех или иных видов сообщества (26) .

Рис. 3. Показатели разнообразия прокариот в сообществах 5-месячных партий препарата БАГС, приготовленных с реактивированными инокулюмами, для хранения которых использовали различные способы: слева — индексы альфа-разнообразия: А — число таксонов (ASVs, amplicon sequence variants), точками отмечены непосредственно значения индексов, боксплот отражает параметры выборки (медианное значение — верхняя и нижняя границы бокса, минимальные и максимальные значения выборки), Б — обратный индекс Симпсона; справа (В) — бета-разнообразие; 1 — свежий БАГС (контроль), 2 — высушивание при +20 ° С, 3 — хранение при - 60 ° C (криоконсервация с 15 % глицерина), 4 — хранение при +4 ° С (метрики Брэя-Кертиса, метод неметрического многомерного шкалирования NMDS) (лабораторный опыт).

Видовое разнообразие сообществ всех трех опытных партий БАГС в 2 раза превышало контроль (рис. 3). Варианты с высушиванием и хранением при +4 °С оказались практически равными по числу таксонов. При этом на основе показателей бета-разнообразия все сообщества отличались по композиции микробного состава. Наиболее схожими были консорциумы контрольного препарата и БАГС, приготовленного с использованием инокулюма после высушивания.

Был проведен сравнительный анализ коровой (общей) части микробиомов контрольного (3-я генерация) и опытных партий препарата. Оценивали относительное число общих таксонов (ASVs) и число прочтений, приходящихся на эти ASVs. Коровый компонент оказался достаточно стабильным. Число общих прокариотических таксонов для контрольного БАГС и варианта с высушиванием составило 2634 (91,7% % прочтений), для контрольного и варианта с хранением при +4 °С — 2510 (84,4 % прочтений), для контрольного и варианта с криоконсервацией — 2317 (82,5 % прочтений).

По показателям обратного индекса Симпсона отмечали достаточно равномерное распределение видов в сообществах вариантов с высушиванием и контрольного.

Основные мажорные компоненты бактериальных сообществ образцов БАГС при всех вариантах хранения относились к представителям фил Pseudomonadota , Planctomycetota и Bacteroidota (рис. 4). На уровне рода в составе микробиомов всех исследованных образцов происходило изменение численности таксонов как в сторону снижения, так и увеличения, а наиболее близким к составу контрольного был образец в варианте с высушиванием. При криоконсервации отмечали снижение представленности ряда прокариот, относящихся к филам Patescibacteria , Acidobacteriota , Chlorof-lexota относительно контроля.

На основе полученных результатов представляло интерес выявить микроорганизмы, ассоциированные с эффективностью (высокая актуальная целлюлозолитическая активность) различных партий БАГС. Мы исходили из того, что в динамике в течение 5 мес стабильная эффективность наблюдалась в контрольном БАГС и в партии, где в качестве инокулюма использовали реактивированный после высушивания образец. Стояла задача выявить в этих вариантах таксоны, достоверно не меняющие или увеличивающие свою численность (LogFC < 1), и обнаружить те же самые таксоны, но снизившие свою относительную представленность, в других партиях препарата с инокулюмом после криоконсервации и хранения при +4 °С (LogFC > 2). Согласно этому критерию были отобраны восемь таксонов — представителей фил Methylomirabilota (WX65), Chloroflexota ( Anaer-olineaceae и Aggregatilineales ), Pseudomonadota (MND1), Patescibacteria ( Grac-ilibacteria ), Bacteroidota ( Chryseolinea ), Acidobacteriota (Subgroup 17) и Plancto-mycetota ( Mariniblastus ) (рис. 5).

Микробный препарат БАГС готовится посредством инкубации торфо-минерально-соломистой смеси в течение 5-6 месв. В качестве ино-кулюма используется свежеприготовленный зрелый препарат предыдущей партии. В процессе приготовления происходит трансформация соломы и растительных остатков торфа, в результате готовый зрелый препарат представляет собой рыхлую массу темного цвета с полностью разложившейся соломой и сформированным консорциумом микроорганизмов, обладающим высокой потенциальной целлюлозолитической активностью. Именно она служит главным критерием эффективности зрелого препарата, используемого в дальнейшем в качестве инокулюма при приготовлении новой партии БАГС.

В нашем эксперименте интересным и практически значимым оказался факт получения зрелых препаратов с хорошей эффективностью при использовании в качестве маточной культуры образцов БАГС, хранящихся в условиях охлаждения (+4 °С) и особенно — в высушенном состоянии. Следует отметить, что эти способы хранения — самые простые и близкие к природным условиям. В естественной среде в процессе эволюции микроорганизмы под воздействием стрессовых, неблагоприятных факторов, в частности в условиях высыхания и замораживания, выработали адаптивный механизм торможения жизнедеятельности микробных клеток (гипобиоз, анабиоз). В анабиотическом состоянии многие микроорганизмы, как споровые, так и неспоровые, сохраняют жизнеспособность без проявления видимых жизненных процессов в течение продолжительного времени (27-29).

Различия между группами на уровне рода

Bacteroidota; Temmonas	2	2,8	2,8	4,6
Pseudomonadota', SWB02	2,3	2,6	3,3	2,9
Bacillota; Neobacillus	1,1	1,1	5,8	1,5
Bacteroidota; Chryseolinea	4	2,5	0,4	0,8
Pseudomonadota; Bauldia	2,5	1,9	1,9	1,4
Pseudomonadota; Acidibacter	1	1,6	1,4	1,4
Patescibacteria; c__ Gracilibacteria_S eq?	2.5	3	0	0
Pseudomonadota; f__ Comamonadaceae_S eq 1	1,4	2,2	1.5	0
Bacteroidota; f Saprospiraceae Seq20	0,5	1,4	0,2	J
Planctomycetota; Pir4 lineage	1,2	1,7	1	1.1
Actinomycetota; Acidiferrimicrobium	1,1	1,3	0,8	1,6
Bacteroidota; Ohtaekwangia	1,2	1	1,4	0,9
Bacteroidota; Chryseotalea	0,5	0,3	1,4	2
Verrucomicrobiota; Candidatus Xiphinematobacter	0,5	1,8	0,2	1,2
Pseudomonadota; Lysobacter	2,1	0,9	0,5	0,3
Pseudomonadota; Bradyrhizobium	1	1	1,3	0,4
Acidobacteriota; о__ Vicinamibacterales_Seq25	0	1,2	1,1	0,7
Pseudomonadota; Reyranella	0,5	1	0,7	1
Verrucomicrobiota; Oleiharenicola	0,6	0,4	1,6	0,2
Pseudomonadota; Devosia	0,8	0,5	0,5	1
Pseudomonadota; f__SC-I-84_Seq23	0,8	1,1	0,9	0
Myxococcota; f__ Haliangiaceae_S eq34	1,4	1	0	0,3
Myxococcota; f__BIrii41_Seq27	0,2	0,3	0,5	1,5
Pseudomonadota; Rhodoplanes	0,8	0,5	0,4	0,8
Pseudomonadota; IS-44	0,8	0,5	0,5	0,5
Pseudomonadota; Pseudorhodoplanes	0,5	0,6	0,6	0,5
Pseudomonadota; MND1	1.2	0,6	0,1	0,3
Pseudomonadota; Hirschia	0,3	0,7	0,7	0,5
Actinomycetota; Gaiella	0.4	0,8	0,2	0,8
Myxococcota; f__BIrii41_Seq36	0,3	0,1	0	1,7
Planctomycetota; Pirellula	0.5	0,6	0,2	0,8
Acidobacteriota; Candidatus Solibacter	0,7	0,4	0,4	0,5
Planctomycetota; f_WD2101 soil group_Seq5	0	1,5	0,4	0,1
Nanoarchaeota; GW2O11_GWC1_47_15	0,3	0,4	1	0,1
Acidobacteriota; Bryobacter	0.4	0,4	0,4	0,6
Verrucomicrobiota; Opitutus	0,2	0,4	0,7	0,5
Pseudomonadota; f Micropepsaceae Seq24	0.4	0,5	0,5	0,4
Pseudomonadota; Rhizobium	0,3	0,6	0,3	0.4
Pseudomonadota; Arsenicitalea	0,3	0,3	0,4	0,7
Pseudomonadota; Pseudolabrys	0,2	0.5	0,3	0,5
Pseudomonadota; Dongia	0,3	0,3	0,4	0,5
Thermoproteota; Candidatus Nitrosocosmicus	0.4	0.7	0,1	0,3
Planctomycetota; SMI AO 2	0,1	0,2	0,4	0.7
Pseudomonadota; Hypericibacter	0,4	0,4	0,5	0,2
Actinomycetota; Ilumatobacter	0,6	0,3	0,2	0,2
Pseudomonadota; Pedomicrobium	0,4	0,2	0.5	0.2
Pseudomonadota; Xylophilus	0,6	0,3	0,2	0,1
Bacteroidota; f NS9 marine group Seq21	0,2	0	0.9	0,1
Chloroflexota; f__ Roseiflexaceae_S eq 150	0,3	0,1	0,6	0,3
Fibrobacterota; f__ Fibrobacteraceae_Seql96	0	0,2	0,8	0,2
Remaining taxa (3739)	59.7	55.5	59.2	59.6
	A	Б	В	Г

Рис. 4. Таксономический состав (%) прокариотических сообществ 5-месячных партий препарата БАГС, приготовленных с реактивированными инокулюмами, для хранения которых использовали различные способы: А — свежий БАГС (контроль), Б — высушивание при +20 ° С, В — хранение при +4 ° С, Г — хранение при - 60 ° C (криоконсервация с 15 % глицерина) (лабораторный опыт).

Существует множество работ, посвященных влиянию способов хранения на выживаемость и активность микроорганизмов. При простом высушивании при комнатной температуре часть из них, безусловно, погибает, но многие могут сохранять жизнеспособность в течение ряда лет (30, 31). Показано, что при кратковременном высушивании или хранении в холодильнике почвенных образцов (3 мес) индексы альфа разнообразия не изменялись (32). Имеются данные о том, что при высушивании происходит значительное снижение грибной части сообщества, при этом бактериальное остается относительно стабильным (33). В случае препарата БАГС его эффективность ассоциирована с прокариотическим компонентом сообщества.

А Б В

Семейство: WX65 (Methylomirabilotd) Семейство: Anaerolineaceae Род: MND1 (Pseudomonadota) Род: Mariniblastus Род: Chryseolinea	0,09	-1,01	-4,15	LogFC 0 1
	-0,39	-2,08	-2,15
	-0,84	-2,58	-1,78
	-0,8	-1,22	-2,84
	-0,6	-2,33	-1,83
Порядок: Subgroup 17 (Acidobacteriota)	-0,95	-2,01	-5,03
Порядок: Aggregatilineales	-0,88	-2,24	-3,11
Класс: Gracilibacteria	0,11	-1,73	-3,05

Рис. 5. Таксоны, достоверно сохраняющие (в сравнении с контролем) численность в 5-месячных партий препарата БАГС, приготовленных с реактивированными инокулюмами, для хранения которых использовали различные способы: А — высушивание при +20 ° С, Б — хранение при - 60 ° C (криоконсервация с 15 % глицерина) В — хранение при +4 ° С (лабораторный опыт). LogFC — натуральный логарифм изменения представленности.

Криоконсервация считается одним из самых эффективных методов длительного сохранения микроорганизмов, многие из которых могут успешно храниться при температуре от -60 до -130 °С (34, 35). С. Yu с соавт. (9) изучили состав целлюлозолитических микробных сообществ, инициированных лигноцеллюлозным субстратом, до и после криоконсервации с глицерином и выявили, что, несмотря на изменения в составе сообщества при хранении, образцы оставались активными после восстановления.

В нашем эксперименте в варианте с криоконсервацией в конечном итоге был получен зрелый препарат с хорошей потенциальной целлюлозолитической активностью консорциума. Ее торможение на начальных этапах приготовления этой партии препарата предположительно было связано с глицерином, взятым в качестве криопротектора при хранении и внесенным в торфо-соломистую смесь вместе с реактивированным после криоконсервации инокулюмом. По-видимому, будучи источником углерода для плесневых грибов (36), глицерин спровоцировал их рост в самом начале инкубации, и причиной слабой активности целлюлозолитиков в первые месяцы приготовления БАГС могла быть конкуренция за источники питания. Наличие глицерина в компостируемой смеси, возможно, способствовало также формированию сообщества, наиболее отличающегося по структуре от других партий.

Состав микробиомов, ассоциированный с эффективностью зрелого

БАГС, довольно специфичен и может быть связан как с расщеплением сложных полисахаридов, так и с азотным обменом. MND1 описан в литературе как нитрификатор (37), а Methylomirabilota как денитрифицирующие метанотрофы (38). Интересна также пара Cryseolinea — Gracilibacteria . Некоторые штаммы Chryseolinea способны к расщеплению компонентов лигноцеллюлозного комплекса, в частности гемицеллюлозы (39, 40), а Gracilibacteria относится к бактериальным эктосимбионтам (41, 42). Основываясь на ранее полученных результатах, у нас есть основание полагать, что Chryseolinea может быть их потенциальным хозяином (43). Представители Anaerolineae и Mariniblastus также обладают значительным метаболическим потенциалом, в том числе имеют широкий набор ферментов, расщепляющих полисахариды (44, 45).

Таким образом, нами получены положительные результаты о возможности консервации и хранения, по крайней мере, в течение полугода, стоковых образцов свежеприготовленного зрелого препарата БАГС с целью использования их после реактивации для приготовления новых партий. Наилучшим и самым простым способом консервации оказалось высушивание. Именно с реактивированным образцом, хранившимся этим способом и используемым в качестве инокулюма, была получена наиболее эффективная партия БАГС с высокой целлюлозолитической активностью. В ней же были выявлены представители микробиома — маркеры эффективного препарата, связанные с азотным обменом и расщеплением сложных полисахаридов, — MND1, Methylomirabilota , Cryseolinea , Gracilibacteria .

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии,