Влияние способов стерилизации и типов эксплантов жимолости синей на их жизнеспособность в условиях in vitro

Высокий спрос населения на посадочный материал жимолости синей традиционные способы вегетативного размножения удовлетворить не позволяют. Исправить ситуацию можно с помощью метода клонального микроразмножения, который позволяет получить в короткий срок необходимое количество сортового оздоровленного посадочного материала [1, 2].

Цель исследований – изучить эффективность разных стерилизаторов при введении эксплантов жимолости синей в культуру in vitro , а также жизнеспособность различных типов эксплантов исследуемых сортов.

Исследования проводили в лабораториях биотехнологии филиала ФБУ ВНИИЛМ «Центрально-европейская ЛОС» и в Костромской государственной сельскохозяйственной академии. Эффективность стерилизаторов при введении эксплантов в культуру in vitro изучали на растениях жимолости сорта Морена. Количество эксплантов составило 30 шт. При этом почки помещали в растворы стерилизаторов с различной экспозицией: моющее средство «Белизна», разведенное водой в соотношении 1:5 (15 мин), «Доместос» – 1:5 (15 мин), 5%-й раствор экостерилизатора (бесхлорного) – 1:1 (15 мин), сулема 0,1% (5 мин). После этого почки многократно промывали стерильной дистиллированной водой. В качестве контроля использовали «Белизну», разведенную 1:5 (15 мин). Мы применяли новый препарат (экостерилизатор) – кислородсодержащий бесхлорный отбеливатель Sinergetic (производитель ООО «Синергетик», г. Нижний Новгород). Это экологически чистый продукт, содержащий только натуральные компоненты, – дистиллированную воду, Н-тензиды (на основе глюкозы), до 15% активного кислорода.

Апексы побегов меристем размером 0,5–1,0 мм изолировали из асептических почек растений жимолости и помещали на питательную среду Мурасиге – Скуга (MS) с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л. Эффективность стерилизации рассчитывали по отношению количества неинфицированных эксплантов к числу эксплантов, введенных в культуру in vitro (в процентах).

В результате исследований установлено, что эффективность стерилизации почек с помощью моющих средств «Белизна» и «Доместос», разведенных 1:5 (экспозиция 15 мин каждый), составила 53 и 63% соответственно. Наибольшим стерилизующим эффектом обладали раствор отбеливателя Sinergetic, разведенный 1:1 (экспозиция 15 мин) и 0,1%-й раствор сулемы (экспозиция 5 мин), где все экспланты (30 шт.) оказались неинфицированными (табл. 1).

Для изучения влияния типа экспланта и сорта на жизнеспособность меристем в условиях in vitro мы отбирали почки с одревесневших побегов и стерильных зеленых черенков

Таблица 1. Влияние различных стерилизаторов при введении в культуру in vitro эксплантов жимолости сорта Морена

Стерилизатор Экспозиция, мин Эффективность стерилизации, % Белизна, разведенная в пропорции 1:5 15 53 Доместос, разведенный в пропорции 1:5 15 63 Экостерилизатор, разведенный в пропорции 1:1 15 100 Сулема 0,1% 5 100 следующих сортов жимолости: Андерма, Бе-рель, Голубое веретено, Длинноплодная, Морена, Нимфа, Роксана. После стерилизации из верхушечных и боковых почек одревесневших побегов вычленяли экспланты меристем размером 0,5–1,0 мм и высаживали in vitro на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 0,5 мг/л 6-БАП. Кроме того, мы вычленяли меристемы апикальных и пазушных почек из стерильных зеленых черенков, культивируемых in vitro, и высаживали на такую же питательную среду.

Культуру апикальных меристем использовали для оздоровления растений, так как в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений. Однако у введенных в культуру in vitro растений-регенерантов при дальнейших пассажах иногда может проявиться внутренняя инфекция. С целью оздоровления и освобождения от внутренней инфекции размноженных in vitro растений мы дополнительно вычленяли апикальные меристемы для получения стерильной, хорошо растущей культуры.

Культивирование эксплантов in vitro осуществляли в культуральной комнате при освещенности до 1 тыс. лк, фотопериоде 16 ч, температуре 23–25 °С и относительной влажности воздуха 70%. Приживаемость меристем, изолированных из различных побегов и почек, определяли на 30-е сут.

Жизнеспособность эксплантов существенно различалась в зависимости от места вычленения меристем. Лучшей приживаемостью отличались меристемы стерильных зеленых черенков, культивируемых in vitro из пазушных и апикальных почек, – в среднем 81 и 70% соответственно (табл. 2).

Жизнеспособность меристем из апикальных почек одревесневших черенков была ниже и составляла в среднем 55%. Наименьшая жизнеспособность наблюдалась у меристем из пазушных почек одревесневших черенков – в среднем 36,4%.

Жизнеспособность аналогичных типов эксплантов in vitro в зависимости от сорта варьировалась в пределах 7–11%, а в среднем она составляла 60–62%.

Выводы.

• 1.    Раствор бесхлорного отбеливателя Sinergetic, разведенного 1:1 (экспозиция 15 мин), не уступал по эффективности 0,1%-му раствору сулемы (экспозиция 5 мин) и значительно превосходил растворы моющих средств «Белизна» и «Доместос», разведенных 1:5, при экспозиции 15 мин.

• 2.    Жизнеспособность меристем in vitro зависела от исходного фрагмента растения и местоположения почек на нем. Меристемы стерильных зеленых черенков отличались более высокой приживаемостью в культуре in vitro , чем из одревесневших побегов. У стерильных зеленых че-

• Таблица 2. Жизнеспособность меристем в зависимости от типа экспланта и сорта, %

Сорт жимолости Меристемы из одревесневших черенков после стерилизации Меристемы из стерильных зеленых черенков, культивируемых in vitro апикальные почки пазушные почки апикальные почки пазушные почки Андерма 57±0,31 30±0,41 73±0,29 81±0,34 Берель 59±0,35 39±0,29 67±0,33 78±0,29 Голубое веретено 58±0,26 31±0,32 74±0,31 79±0,45 Длинноплодная 57±0,32 37±0,37 73±0,28 80±0,33 Морена 51±0,36 39±0,38 72±0,32 82±0,42 Нимфа 49±0,40 38±0,29 68±0,34 85±0,25 Роксана 56±0,31 41±0,38 64±0,39 84±0,35 Среднее 55,3 36,4 70,1 81,3 ренков отмечалась более высокая жизнеспособ- 3. Жизнеспособность аналогичных типов ность меристем из пазушных почек, а у одревес- эксплантов in vitro в зависимости от сорта разли-невших побегов – из апикальных. чалась незначительно.