Влияние субстрата селекции на полихлорбифенил-деградативную активность аэробных почвенных бактериальных ассоциаций

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) входят в первоначальный список стойких органических загрязнителей (СОЗ) и подлежат полному выводу из производства и применения, а также должны быть уничтожены [Final act …, 2001]. Помимо существенных объемов, находящихся на захоронении, значительные количества ПХБ оказались в почвах, донных отложениях и других объектах окружающей среды [Devi, 2020].

По химической структуре ПХБ представляют собой два ароматических кольца, соединенных С-С-связью с заместителями – атомами хлора. Количество заместителей в молекуле может быть от 1 до 10. В промышленности выпускались смеси ПХБ, включающие в себя 40–70 конгенеров ПХБ с разным количеством хлора в молекулах. Наиболее распространенные торговые марки ПХБ – Арок-лор, Делор, Клофен, Совол, Трихлорбифенил (ТХБ) [Murinova, Dercova, 2014; Reddy, Moniruz-zaman, Aminabhavi, 2019; Devi, 2020].

Вследствие эволюционной пластичности, ряд почвенных бактерий не только адаптировались к присутствию ПХБ, но и оказались способны осуществлять биотрансформацию данных поллютантов [Su et al., 2015; Hoostal, Bouzat, 2016]. Разложение ПХБ осуществляется как анаэробными, так и аэробными бактериями [Parales, Resnik, 2006; Kolar et al., 2007; Ilori, Robinson, Adebusoye, 2008; Liz et al., 2009; Chang et al., 2013; Jia et al., 2019; Pathirajia et al., 2019]. Анаэробному восстановлению подвергаются высокохлорированные конгенеры ПХБ, в результате чего образуются средне- и низкохлорированные конгенеры [Matturro et al., 2016; Pathirajia et al., 2019]. Аэробные бактерии осуществляют окислительное расщепление молекулы ПХБ, что приводит к образованию хлорбензойных кислот с последующей их утилизацией [Parales, Resnik, 2006; Kolar et al., 2007; Ilori, Robinson, Adebusoye, 2008; Liz et al., 2009; Chang et al., 2013; Jia et al., 2019]. Биодеструкцию ПХБ осуществляют как индивидуальные штаммы бактерий, так и ассоциации [Kolar et al., 2007; Liz et al., 2009; Chang et al., 2013; Cervantes-González et al., 2019].

В большинстве случаев, химическое загрязнение почв носит смешанный характер. Наряду с ПХБ, в почве присутствуют и другие органиче-ские/хлорорганические загрязнители [Revich, Shelepchikov, 2008]. Типичным примером являются почвы г. Чапаевска Самарской обл., Россия. В них обнаруживаются в высоких концентрациях такие загрязнители группы СОЗ, как ПХБ, линдан, ДДТ [Revich et al., 2001; Назаров и др., 2016]. Вследствие чего в почвах таких районов формируются микробоценозы, обладающие широким диапазоном биодеградативной активности [Shah et al., 2013; Wu et al., 2013; Su et al., 2015; Hoostal, Bouzat, 2016].

Цель настоящего исследования – выделение из почв, загрязненных несколькими соединениями группы СОЗ, микробные ассоциации, обладающие полихлорбифенил-деградативным потенциалом, при использовании в качестве селективного субстрата различные ароматические соединения.

Материалы и методы исследования

Почвенные образцы

Образцы почв RS1 и RS2 были отобраны на территории ОАО «Средне-Волжский завод химикатов» (г. Чапаевск Самарской обл.) в летний период 2018 г. Отбор почв производили согласно ГОСТ 17.4.4.02-84. Далее транспортировались с соблюдением температурного режима в г. Пермь для дальнейшего исследования в стационарных условиях. Ранее было установлено, что почвы данного района загрязнены такими соединениями группы СОЗ как линдан, гексахлорбензол, ДДТ и ПХБ [Назаров и др., 2016].

Среда культивирования, реактивы

Минеральная среда К1, состава (г/л): K 2 HPO 4 *3H 2 O – 3.2, NaH 2 PO 4 *2H 2 O – 0.4, (NH 4 ) 2 SO 4 – 0.5, MgSO 4 *7H 2 O – 0.15, Ca(NO 3 ) 2 – 0.01. Для получения плотных питательных сред вносили агар-агар до конечной концентрации 1.5%.

В работе использовали аналитически чистые химические реактивы, бифенил (>98%), нафталин (>98%), орто -фталат (>98%) фирмы Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), ТХБ (ОСТ 6-01-2485), Совол (ОСТ 6-01-24-75) – коммерческие смеси полихлорированных бифенилов, Россия.

Накопительное культивирование

• 10 г почвенного образца помещали в колбу Эр-ленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл среды К1 и 1 г/л соответствующего селективного субстрата ( орто -фталат, нафталин, бифенил). Колбы выдерживали в термостате (ТС-1/80 СПУ, Россия) при +28˚С 30 дней.

Стабильные бактериальные ассоциации

• 10 мл бактериальной культуры, полученной при накопительном культивировании с селективным субстратом, помещали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 90 мл среды К1 и 100 мг соответствующего субстрата ( орто -фталат, нафталин, бифенил). Культивирование проводили на термостатируемой круговой качалке (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, “BioSan”, Латвия) при 120 об/мин и +28˚С в течение 14 дней. Последующие пересевы (на среду К1 и соответствующий субстрат в концентрации 1 г/л) производили через каждые 7 дней. Бактериальное сообщество считали стабильным, если при 10 последовательных пересевах морфологические и физиологические характеристики сообщества не изменялись.

Периодическое культивирование, анализ ростовых параметров

• 10 мл стабильной бактериальной культуры помещали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 90 мл среды К1 и 100 мг соответствующего субстрата выделения ( орто -фталат, нафталин, бифенил) или субстрата деструкции (бифенил). Культивирование проводили на термостатируемой круговой качалке (Environmental ShakerIncubator ES 20/60, “BioSan”, Латвия) при 120 об/мин и +28˚С в течение 4–14 дней. Каждые 24 ч. производили измерение оптической плотности культуры на спектрофотометре BioSpec-mini, «Shimadzu», Япония, при длине волны 600 нм.

Удельную скорость роста рассчитывали по классической методике согласно формуле

μ = (LnC x ‒LnC 0 )/ (t x ‒t 0 ), где C x – концентрация культуры в высшей точке роста, C 0 – концентрация культуры в начальный момент роста, t 0 и t x – время в начале и конце логарифмической фазы роста культуры.

Деструкция смесей ПХБ

При исследовании деструкции смесей полихлорбифенилов (ТХБ, Совол) 1 мл отмытых дважды в среде К1 клеток (ОД 600 = 1.5–2.0), выращенных на бифениле (1 г/л) до середины логарифмической фазы, переносили во флаконы объемом 5 мл с тефлоновыми крышками, добавляя субстраты до конечной концентрации ТХБ – 13.8 мг/л, Совол – 55 мг/л и инкубировали на шейкере (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, “BioSan”, Латвия) 200 об/мин при 28˚С. Для анализа пробы отбирали в начальный момент времени, а также на 4- и 8-е сут.

Аналитические процедуры

Количественный анализ ПХБ проводили в условиях ГХ-ПИД: газовый хроматограф “Shimadzu GC 2010” с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой ZB-5 (длина 30 м, диаметр 0.25 мм), толщина пленки неподвижной фазы составляла 0.25 мкм (Shimadzu, Япония). Начальная температура колонки ‒ 40°С (3 мин.) с последующим её повышением 10°/мин до конечной температуры 280°С (изотерма 15 мин.). Температура испарителя ‒ +250°С, детектора – +300°С.

Расчет содержания ПХБ в каждом исследуемом образце проводили методом внутренней нормализации, рассчитывая вклад отдельных соединений в суммарную площадь пиков. На основании полученных расчетных площадей пиков оценивали содержание исходных ПХБ после процесса биодеструкции.

Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом ВЭЖХ. Для анализа культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток центрифугированием (9660 g в течение 3 мин. на центрифуге miniSpin («Eppendorf», Германия)). Образование продуктов мета- расщепления ароматического кольца хлорбифенилов – 2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновые кислоты (ГОФДК) анализировали в надосадочной жидкости на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при Х макс от 390 нм до 440 нм.

Наличие ионов хлора в супернатанте определяли на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при Х _макс от 460 нм до 540 нм через 5 мин. после внесения в супернатант

5%-ного азотнокислого серебра. Количественную оценку проводили согласно калибровочной кривой. Наличие в супернатанте хлорбензойных (ХБК) кислот определяли на хроматографе LC-20A («Shimadzu», Япония) с колонкой Discovery C18 (150 х 4.6 мм или 250 х 4.6 мм) («Supelco», «Sig-ma-Aldrich», США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил-0.1%-ный Н 3 РО 4 (70:30). Идентификация осуществлялась с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоты пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.

Скорость деструкции ПХБ

Скорость деструкции субстрата рассчитывали по формуле

V=(С0 – Ci)/((ti – t0)·Ccell), где C0 – концентрация смеси ПХБ в начальный момент времени, мг/л, Сi – концентрация смеси ПХБ в конечный момент времени, мг/л, ti – конечный момент времени, сут., t0 – начальный момент времени, сут.,·Ccell – концентрация клеток бактериальной ассоциации, г.

Концентрацию клеток рассчитывали исходя из того, что 0.432 мг сухих клеток соответствует 1 мл бактериальной суспензии с ОП 600 = 1.0 о.е.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.

Результаты и их обсуждение

В результате селекции на ароматическом субстрате ( орто -фталат, нафталин, бифенил) были получены 6 бактериальных ассоциаций (табл. 1).

Таблица 1 Бактериальные ассоциации, селектированные из загрязненных почв

Почвенный образец	Субстрат селекции
	орто -фталат	бифенил	нафталин
RS1	R21	R24	R26
RS2	R65	R63	R62

При периодическом культивировании на субстрате выделения данные ассоциации характеризовались стабильной удельной скоростью роста и достигали за 4 сут. сходных значений плотности культуры при многократных пересевах (табл. 2).

Наибольшей удельной скоростью роста характеризовались ассоциации R24 и R63, изолированные с применением бифенила в качестве селективного фактора. Вероятно, ферментативные системы бактерий, входящих в микробоценоз почв территории ОАО «СВЗХ» г. Чапаевска, более адаптированы к окислению соединений группы ПХБ, чем соединений груп- пы полиароматических углеводородов (ПАУ). Подобное явление может быть обусловлено длительным загрязнением данных почв полихлорированными бифенилами.

Таблица 2

Ростовые показатели бактериальных ассоциаций

Бактериальная ассоциация	Субстрат селекции		Субстрат деструкции
	ОП 600 , о.е.	μ, сут-1	ОП 600 , о.е.	μ, сут-1
R21	0.407±0.002	0.136	0.001±0.0002	‒
R65	0.428±0.001	0.142	0.001±0.0004	‒
R24	0.854±0.002	0.284	1.018±0.002	0.339
R63	0.704±0.003	0.234	0.727±0.001	0.242
R26	0.562±0.002	0.187	0.546±0.002	0.182
R62	0.664±0.002	0.221	0.488±0.005	0.162

Анализ биодеградативного потенциала выделенных бактериальных ассоциаций в отношении бифенила показал, что при периодическом культивировании ассоциации R21 и R65, селектированные на орто-фталате, не способны использовать бифенил в качестве источника углерода и энергии (табл. 2). Ассоциации R26 и R62, изолированные на нафталине, демонстрируют близкие ростовые параметры как в случае применения в качестве ростового субстрата нафталина, так и бифенила. Ассоциации R24 и R63 обладают наибольшей скоростью роста и достигают более высокой плотности культуры (табл. 2). Следует отметить, что все изолированные в настоящем исследовании бактериальные ассоциации, проявившие способность расти на бифениле как источнике углерода, обладают более высокой удельной скоростью роста по сравнению с ассоциацией, выделенной из почв штата Веркруз (Мексика), загрязненных трансформаторным маслом, но уступают по данному параметру штаммам, изолированным из донных отложений, загрязненных коммерческими смесями ПХБ (Словакия) [Liz et al., 2009; Horváthová, Lászlová, Derkova, 2018]. Ассоциации R24 и R63 при культивировании на бифениле обладают плотностью культуры, сопоставимой с аналогичным показателем штамма Pseudomonas aeruginosa TMU56 [Hatamian-Zarmi et al., 2009]. Ассоциации R26 и R62 характеризуются более низкой плотностью культуры как при культивировании на нафталине, так и при культивировании на бифениле, чем штамм P. aeruginosa TMU56. Стоит отметить, что штамм P. aeruginosa TMU56 более активно растет при использовании бифенила в качестве ростового субстрата, а не нафталина. У изолированных в настоящем исследовании бактериальных ассоциаций подобной закономерности не выявлено.

Установлено, что ассоциации R26, R62, R24 и R63 осуществляют разложение коммерческих смесей ПХБ – ТХБ и Совол (рис. 1, 2, табл. 3). За 8 сут. инкубации деструкция ТХБ бактериальными ассоциациями составила 99.7–99.8%. Аналогичный показатель в случае трансформации Совола составил 99.6–99.8%. В ряде работ описаны бактериальные сообщества и индивидуальные штаммы, способные разлагать коммерческие смеси ПХБ. Так штаммы рода Rhodococ-cus , выделенные из смешанных культур ПХБ-загрязнённых донных отложений (Хорватия), осуществляют деструкцию Ароклора 1248 (близок по составу конгенеров к Соволу) на 5–61% [Kolar et al., 2007], а штаммы, изолированные в Норвегии, разлагают Ароклор 1242 (аналог ТХБ) на 50% [Papale et al., 2017]. Большая деградативная активность в отношении Ароклора 1242 описана для штамма P. aeruginosa TMU56 – 73.3% [Hatamian-Zarmi et al., 2009]. Бактериальные сообщества, состоящие из штаммов-деструкторов бифенила (Словакия), осуществляют разложение Делора 103 (аналог ТХБ) на 73–85%, тогда как деградативная активность в отношении Ароклора 1242 бактериальной ассоциации 1-2Mix (Южная Корея) составляет 63.0–71.1% [Kwon et al., 2008; Horváthová, Lászlová, Derkova, 2018]. Стоит отметить, что активность сообщества, описанного G. Pathiraja с коллегами [2019] в отношении Ароклора 1260, содержащего большее число высокохлориро-ванных конгенеров, чем смеси ТХБ и Совол, составляет 49.2%. Таким образом, изолированные в настоящем исследовании бактериальные ассоциации эффективно разлагают коммерческие смеси ПХБ.

Таблица 3

Образование хлорбензойных кислот при разложении смесей ПХБ бактериальными ассоциациями, мг

Бактериальная ассоциация	ТХБ		Совол
	4 сут.	8 сут.	4 сут.	8 сут.
R24	0.064±0.001	0.109±0.001	0.018±0.002	0.028±0.004
R63	0.078±0.001	0.106±0.002	0.028±0.002	0.027±0.003
R26	0.039±0.002	0.146±0.001	0.046±0.002	0.058±0.002
R62	0.085±0.001	0.321±0.001	0.011±0.003	0.016±0.002

Рис. 1 . Деструкция ТХБ и выделение метаболита (ГОФДК) бактериальными ассоциациями

Рис. 2. Деструкция Совола и выделение метаболита (ГОФДК) бактериальными ассоциациями

Анализ образующихся метаболитов показал, что биодеструкция конгенеров ПХБ происходит по классическому окислительному пути. При этом в среде фиксируется образование таких промежуточных продуктов, как гидрокси-оксо-фенилгек-садиеновые кислоты (ГОФДК) и хлорбензойные кислоты (рис. 1, 2, табл. 3). Динамика накопления ГОФДК в среде при деструкции ТХБ имеет схожий характер у всех исследуемых ассоциаций (рис. 1). Напротив, при разложении Совола, динамика накопления ГОФДК ассоциацией R62 приближает- ся к линейной, чем существенно отличается от аналогичного показателя остальных ассоциаций (рис. 2). Совол является более токсичным для бактериальных клеток, чем ТХБ, так как содержит большее количество пента- и гексахлорированных конгенеров. Вероятно, в данном случае проявляется токсическое действие образующихся полихлорированных ГОФДК на клетки штаммов ассоциации R62 и замедляет процесс дальнейшего окисления ГОФДК до хлорбензойных кислот. Данная гипотеза подтверждается и более низкой концентраций ХБК в среде у ассоциации R62 при разложении Совола, чем при разложении ТХБ, а также по сравнению с концентрацией ХБК в культуральной среде остальных исследуемых бактериальных ассоциаций (табл. 3).

Стоит отметить, что при анализе концентраций, отражающих содержание в среде как исходного субстрата, так и образующихся метаболитов, не выявлено различий в деградативной активности между ассоциациями, изолированными на нафталине, и ассоциациями, изолированными на бифениле.

Для дальнейшего анализа был произведен расчет скорости деструкции смесей ПХБ бактериальными ассоциациями, с учетом веса биомассы (табл. 4).

Таблица 4

Скорость деструкции смесей ПХБ бактериальными ассоциациями, мг ПХБ сут-1 г сух биомассы-1

Бактериальная ассоциация	ТХБ	Совол
R24	42.82	15.21
R63	59.89	13.32
R26	35.40	15.61
R62	35.55	15.23

Установлено, что скорость деструкции ТХБ ассоциациями, селектированными на бифениле, превышает аналогичный показатель ассоциаций, изолированных на нафталине в 1.2–1.7 раза. Напротив, скорость деструкции Совола у всех ассоциаций была сопоставима друг с другом. Вероятно, в данном случае, существенную роль оказывает состав смеси ПХБ, а не первоначальный субстрат селекции, оказывавший давление на формирование бактериальной ассоциации.

Заключение

В результате проведенных исследований получены шесть бактериальных ассоциаций с разным биодеградативным потенциалом. Установлено, что в случае, если селективным субстратом выделения ассоциации является моноароматическое соедине- ние, то сформировавшиеся бактериальные сообщества не проявляют активности к ПХБ. Напротив, при использовании в качестве селективного субстрата бифенила и нафталина, сформировались сообщества аэробных бактерий с близкими биоде-градативными характеристиками в отношении коммерческих смесей ПХБ. Описанные ассоциации могут служить основой для биоремедиацион-ных технологий, направленных на очистку окружающей среды от полихлорированных бифенилов.

Работа выполнена в рамках НИОКР АААА-А19-119112290009-1 «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды». Анализ методом газовой хроматографии выполнен с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Спектроскопия и анализ органических соединений» (ЦКП «САОС»).