Влияние техногенного засоления почвы на бактериальные сообщества ризосферы растений мятлика лугового (Poa pratensis L.)

В настоящее время около 10% поверхности континентов покрыто засоленными почвами, при этом из-за климатических изменений и антропогенного воздействия на окружающую среду отмечается тенденция к увеличению площади почв с повышенной минерализацией [Лопатовская, Сугаченко, 2010]. Известно, что ризосферные микроорганизмы могут снижать стрессовое воздействие на растения различных факторов, в том числе и засоления [Dimkpa, Weinand, Asch, 2009]. Поэтому исследования ризосферных микробных сообществ при техногенном за- солении почв важны с теоретической точки зрения, так как дают материал для анализа механизмов функционирования растительно-микробных симбиозов данных экосистем. Кроме того, исследования подобных сообществ могут быть использованы для создания биотехнологий, повышающих продуктивность растений при засолении почв, что определяет практическую важность данной проблемы.

Однако ризосферные бактериальные сообщества растений, произрастающих на засоленных почвах, изучены относительно слабо. Имеющиеся

исследования охватывают территории с засушливым климатом и прибрежно-морские регионы, где данная проблема стоит наиболее остро [Bharathkumar et al., 2008; Castellanos et al., 2009; Mapelli et al., 2013]. Между тем воздействие техногенного засоления почвы на ризосферные бактериальные сообщества в условиях гумидного климата остается практически не изученным.

Цель исследования – изучить влияние техногенного засоления на бактериальные сообщества ризосферы растений.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись бактериальные сообщества ризосферы растений вида мятлик луговой (Poa pratensis L.), доминирующего в растительных сообществах района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Соликамск, Пермский край). Четыре участка, с которых в июле 2013 г. были отобраны образцы засоленных почв, расположены вблизи солеотва-лов калийных предприятий СКПРУ1 (участок 5) и СКПРУ2 (участки 2–4). Почвенные образцы с участка 1, имевшего незасоленную почву и находящегося в 1.6 км от ближайшего солеотвала, были отобраны в качестве контрольных (табл. 1).

Почва на всех участках была охарактеризована как дерново-подзолистая суглинистая. Отбор и подготовку почвенных образцов для агрохимического и микробиологического анализов проводили согласно методическим рекомендациям [Методы…, 1991; Практикум…, 2001]. Агрохимический анализ почвы проводился стандартными методами [Практикум…, 2001]. Содержание в почве кальция (Ca2+), магния (Mg2+), натрия (Na+), калия (K+) определяли на атомно-абсорбционном спектрометре AA-6300 (Shimadzu, Япония). Основные физикохимические характеристики почвы приведены в табл. 1.

Таблица 1

Географические координаты и агрохимические характеристики исследованных участков

Показатель	Участки
	1	2	3	4	5
Координаты участков	59°33'17" с.ш., 56°44'28" в.д.	59°33'59" с.ш., 56°45'52" в.д.	59°33'55" с.ш., 56°45'60" в.д.	59°34'02" с.ш., 56°46'04" в.д.	59°37'59" с.ш., 56°45'11" в.д.
pH водный	6.1	8.3	7.4	7.6	7.7
Ca2+, мг/кг	56±7	2419±394	895±86	649±102	1186±234
Mg2+, мг/кг	23±2	115±20	100±11	95±17	539±68
Na+, мг/кг	5±2	5750±278	1315±98	1320±196	1944±189
K+, мг/кг	7±1	53±7	286±41	577±38	396±43
P 2 O 5 , мг/кг	100±5	113±14	252±26	180±11	118±32
NO 3 -, мг/кг	10±2	12±3	7±1	26±3	24±2
NH 4 +, мг/кг	10±3	49±4	67±4	16±2	28±3
Гумус, %	2.4	1.5	1.4	1.2	3.5

Для учета численности, выделения и культивирования бактерий использовали агаризованную богатую среду Раймонда (БСР) с добавлением в нее (г/л): триптона – 5.0, дрожжевого экстракта – 2.5, NaCl – 50.0 и агара – 15.0 [Розанова, Назина, 1982]. Изоляты для дальнейшего изучения отбирали на основании морфологии колоний (цвет, форма, размер, поверхность, профиль, структура). Штаммы с отличающимися морфологическими признаками пересевались на БСР и далее были использованы для таксономического анализа, основанного на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. На основании полученных морфологических и генетических данных все штаммы были отнесены к отдельным операционным таксономическим единицам (ОТЕ). Численность бактерий выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы.

Амплификацию, секвенирование и филогенетический анализ гена 16S рРНК изолированных бактерий выполняли согласно описанию, представленному в работе [Anan`ina et al., 2011].

ленному в работе [Anan`ina et al., 2011]. Секвенирование проводили на приборе Genetic Analyzer 3500XL (Applied Biosystems, США), следуя инструкциям фирмы-производителя.

Таксономическое разнообразие бактериальных сообществ оценивали с использованием индекса Шеннона [Мэггеран, 1992].

Результаты и их обсуждение

На выбранных для исследования участках, расположенных возле солеотвалов (участки 2–5), концентрация Na+ выше, чем в незасоленной почве (участок 1), в 263.1–1150.0, K+ – 7.5–81.2, Ca2+ – 11.5–42.7, Mg2+ – в 4.1–23.4 раза (табл. 1).

Результаты проведенной работы показали, что техногенное засоление почвы негативно влияло на численность гетеротрофных бактерий в ризосферной зоне изученных растений. Так, численность бактерий в ризосфере растений, произрастающих на засоленной почве, была в 3.4–8.7 раз меньше, чем в ризосфере растений, произрастающих на почве без засоления (табл. 2). С другой стороны, образцы ризосферы, отобранные на участке с незасоленной почвой, характеризовались меньшим разнообразием бактерий, чем образцы ризосферы растений, произрастающих на почве с засолением. При этом наиболее высокие значения индекса Шеннона и ОТЕ были выявлены в образцах ризосферы, отобранных на участке 2, почва которого содержала наиболее высокую концентрацию Na+ (табл. 2).

Таблица 2

Влияние техногенного засоления на численность и разнообразие гетеротрофных бактерий в ризосфере растений

Номер участка	Численность бактерий	Индекс Шеннона	Количество ОТЕ
1	(8,4±1,5)х107	1,47	4
2	(2,5±0,4)х107	2,52	10
3	(1,4±0,3)х107	1,57	8
4	(1,4±0,5)х107	1,49	5
5	(1,2±0,2)х107	1,29	4

Полученные нами результаты не противоречат торым повышенное содержание солей натрия в почве также может оказывать как отрицательное [Ibekwe et al., 2010; Wang et al., 2014], так и положительное [Yang et al., 2016] воздействие на разнообразие бактерий в ризосферных сообществах.

Засоление почвы влияет также и на таксономическую структуру ризосферного бактериального сообщества растений Poa pratensis L. Таксономический профиль бактериального сообщества прикорневой зоны растений незасоленной почвы (участок 1) типичен для большинства изученных ризосферных сообществ и представлен ба ктериями родов Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria ) и Microbacterium (класс Actinobacteria ), доля которых в общей численности изолированных бактерий составляла 98.8 и 1.2%, соответственно (рисунок). Высокий уровень минерализации влияет на снижение доли в ризосферном бактериальном сообществе представителей класса Gammaproteobacteria и к увеличению доли бактерий, принадлежащих к классам Actinobacteria (участки 2 и 3), Flavobacteria (участок 3), Alphaproteobacteria (участки 4 и 5), Bacilli (участки 4 и 5) (рисунок, А).

результатам других исследователей, согласно ко-

S Isoptericola SZhihengliuella

• ■    Kocuria SAlteromonas

• ■    Kushneria я Microbacterium И Pseudomonas D Halomonas

Соотношение филогенетических групп бактерий (А – классы, Б – роды), основанное на количестве

ОТЕ, изолированных из ризосферы Poa pratensis L. с участков:

1 – незасоленная почва, 2–5 – засоленная почва

Большинство выделенных из засоленных почв штаммов бактерий (76% штаммов) имели наибольшее сходство по генам 16S рРНК с типовыми галофильными и галотолерантными бактериями, изолированными из экосистем с повышенной соленостью. Так, на участках 2, 3 и 5 в микробных сообществах ризосферы мятлика доминировали умеренно-галофильные бактерии родов Kushneria и Halomonas семейства Halomonadaceae класса Gammaproteobacteria [Oren, 2008] (рисунок, Б). На участке 4 так же, как и в варианте с незасоленной почвой, в ризосфере доминировали представители рода Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria), однако они были наиболее близки по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК к морской галофильной бактерии Pseudomonas xan-thomarina KMM 1447T [Romanenko et al., 2005]. Изученные ризосферные микробные сообщества имеют определенное сходство по таксономической структуре с бактериальными сообществами ризосферы клубнекамыша морского (Bolboschoenus maritimus) и бескильницы болотной (Puccinellia limosa), произрастающих на берегах соленых озер национального парка Кишкуншаг в Венгрии [Borsodi et al., 2015], а также с ризосферными сообществами бактерий солероса шишковидного (Salicornia strobilacea) с солончаков, расположенных на юге Туниса [Mapelli et al., 2013]. Особенностью данных ризосферных бактериальных сообществ являлось доминирование бактерий сем. Halomonadaceae (виды родов Halomonas, Kushneria), а также высокая доля в численности представителей классов Actinobacteria и Bacilli.

Заключение

Таким образом, обнаружены следующие изменения в микробном сообществе ризосферы мятлика лугового под действием техногенного засоления вблизи солеотвалов, образованных при разработке Верхнекамского месторождения солей (Пермский край): снижение численности и увеличение таксономического разнообразия гетеротрофных бактерий; уменьшение доли бактерий – представителей класса Gammaproteobacteria ; увеличение доли бактерий, принадлежащих к классам Actinobacteria (участки 2, 3), Alphaproteobacteria (участки 4, 5), Flavobacteria (участок 3), Bacilli (участки 4, 5); изменение таксономического состава бактериального сообщества. На участках с засоленной почвой в ризосфере доминировали умеренно-галофильные бактерии сем. Halomonadaceae (участки 2, 3 и 5) и галофильные бактерии рода Pseudomonas (участок 4), что указывает на наличие возможных симбиотических связей между данными бактериями и растениями в условиях засоления.

Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК 31 штамма бактерий, выделенных из ризосферы мятлика лугового, депонированы в базе данных GenBank под номерами KC992726-28, KF010924, KF010926-28, KJ659914, KJ669363, KJ669366-71, KJ679338-53.