Влияние технологии экстракции на антиоксидантную активность черноплодной рябины Arónia melanocárpa, брусники Vaccínium vítis-idaéa, черники Vaccínium myrtíllus, малины Rúbus idáeus, вишни Prúnus subg. cérasus, черной смородины Ríbes nígrum

Н. В. Макарова, Н. Б. Еремеева*, Д. Ф. Игнатова *Самарский государственный технический университет, г. Самара, Россия; ORCID: , e-mail:

В настоящее время актуальной задачей развития системы рационального питания является создание оптимальной технологии извлечения комплекса веществ с антиоксидантным действием из широко распространенных на территории РФ ягод и фруктов. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что пищевые продукты, богатые антиоксидантами и обладающие антиоксидантной активностью, снижают риск заболеваний, в том числе некоторых видов рака ( Shashirekha et al., 2015 ). Многие продукты (например, томаты, оливковое масло, брокколи, лук, ягоды, мед, чай, виноград, алое-вера, розмарин, базилик, перец чили, морковь, куркума, гранат) содержат компоненты, участвующие в канцерогенезе, ингибируют видоизменение клеток и метастазирование (в основном это действие обусловлено наличием таких соединений, как полифенолы).

В процессе изучения указанной проблемы ( Adams et al., 2011; Yang et al., 2019 ) установлено, что порошок черники препятствует росту метастаз на линии клеток MDA-MB-231 мышей, а ацилированные антоцианы из черники оказывают противораковый эффект на линии клеток Н22 ( Liu et al., 2016 ).

В обзоре ( Baby et al., 2018 ) суммированы данные по исследованиям in vitro и in vivo взаимосвязи между антиканцерогенными и антиоксидантными свойствами; в обзоре ( de Castro et al., 2015 ) представлены результаты исследований положительного влияния фитохимических соединений ягод в профилактике оксидативного стресса и карциногенеза.

Целью исследования ( Diaconeasa et al., 2015 ) является оценка антиканцерогенного потенциала фракций сока черники и голубики, богатых антоцианами, на линии клеток рака; была также изучена антиоксидантная активность соков по методам DPPH и ORAC. По мнению авторов, антиканцерогенные свойства антоцианиновых фракций напрямую взаимосвязаны с содержанием биоактивных молекул, антоцианов и появлением антиоксидантной активности.

Фенольные соединения фруктов обладают, кроме антиоксидантных, также и антимикробными, пребиотическими, противовоспалительными и другими свойствами ( Chang et al., 2019 ). Но основным положительным свойством фитохимических соединений ягод является их способность предотвращать многие заболевания, в том числе и сердечно-сосудистые ( Yang et al., 2019 ). Экстракт аронии оказывает более существенный противовоспалительный эффект по сравнению с экстрактами черной смородины и шиповника ( Strugała et al., 2016 ).

Исландские ученые ( Adams et al., 2010 ) изучили хемотерапевтическую активность экстракта голубики на линии клеток рака груди. Полученные данные свидетельствуют об ингибировании роста и метастатического потенциала на линии клеток MDA-MB-231 по пути PI3K/AKT/NF NFKB.

В ходе экспериментальных исследований на лабораторных животных установлено ( Rocha et al., 2019 ), что черника и клюква могут снижать уровень глюкозы в крови, тем самым способствуя контролю развития диабета 2-го типа.

Для сохранения свойств ягоды черники во время хранения на первоначальном уровне предлагается ( Chiabrando et al., 2015 ) использовать покрытие хитозаном или альгинатом натрия. При этом остаются неизменными показатели содержания антоцианов, фенолов, антиоксидантной активности.

Целью исследования словацких ученых ( Vollmannova et al., 2014 ) было определение содержания Cu, Zn, Cd и Pb, общих полифенолов, антиоксидантной активности шести сортов клюквы и шести сортов черники, собранных в различных районах Словакии (как культурных, так и диких); при этом установлено, что более положительными свойствами обладают культурные сорта.

Среди ряда ягод, исследованных на наличие антиоксидантной активности in vitro, именно арония является лучшим антиоксидантом ( Denev et al., 2012 ). В работе ( Matziouridou et al., 2016 ) предлагается использовать клюкву как средство против образования атеросклеротических бляшек.

Экспериментальные данные, полученные в ходе изучения взаимосвязи антиоксидантных свойств и способности транспортировать эритроциты и липиды сквозь мембраны клетки, доказали эффективность черной смородины как биологического субстрата ( Cyboran et al., 2014 ).

Итальянские ученые исследовали 43 образца сладкой вишни из региона Campania на наличие антиоксидантных метаболитов с энзиматической активностью ( Mirto et al., 2018 ).

Из малины был выделен ( Yu et al., 2015 ) новый водорастворимый кислый полисахарид RCP-II, являющийся композитом галактуроновой кислоты и рамнозы, арабинозы, ксилозы, глюкозы, галактозы. RCP-II обладает антиоксидантными свойствами и неэнзиматической активностью по ингибированию гликирования.

Большое количество работ посвящено поиску оптимальной технологии экстрагирования для получения биологически активных компонентов ( Soquetta et al., 2018 ). При этом в качестве методов интенсификации процессов экстрагирования может быть использовано как микроволновое ( Vieira et al., 2017 ), так и ультразвуковое ( Khoigani et al., 2017 ) облучение.

Таким образом, ягоды, косточковые являются перспективным сырьем для получения антиоксидантов, которые также интересны в качестве потенциальных антиканцерогенных веществ. При этом решающую роль в уровне антиоксидантной активности экстрактов ягод играют методы и условия экстракции.

Целью настоящего исследования является определение влияния технологии экстракции на антиоксидантную активность экстрактов из черноплодной рябины, брусники, черники, малины, вишни, черной смородины. В процессе экспериментальной работы решались следующие задачи: 1) проведение сравнительного анализа показателей общего содержания фенолов, флавоноидов, антирадикальной активности по улавливанию свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила, восстанавливающей силы, антиоксидантной активности, полученных при использовании трех технологий экстрагирования (настаивания, микроволнового облучения, ультразвуковой обработки); 2) выбор наиболее оптимальной технологии экстрагирования.

Материалы и методы

Исходные фрукты . В качестве образцов ягод и косточковых использовали сортосмесь фруктов из коллекции Научно-исследовательского института садоводства и лекарственных растений "Жигулевские сады" (г. Самара) урожая 2018 г. Для экстракции исходное сырье (ИС) было измельчено до размера 1,0–2,0 мм.

Метод мацерации для приготовления экстракта фруктов. Навеску измельченных фруктов 1 г (для экстракта концентрацией 0,1 г/см ³ ) помещали в колбу с притертой пробкой, добавляли 10 мл 98%-го этилового спирта, разбавленного водой в соотношении 1 : 1, выдерживали в термостате при 37 ºС в течение 2 ч при непрерывном перемешивании; далее отделяли прозрачный слой экстракта посредством центрифугирования в течение 15 мин при скорости 3 000 об/мин.

Метод приготовления экстракта фруктов с использованием микроволнового излучения. Навеску измельченных фруктов 1 г (для экстракта концентрацией 0,1 г/см ³ ) помещали в колбу с притертой пробкой, добавляли 10 мл 98%-го этилового спирта, разбавленного водой в соотношении 1 : 1, обрабатывали микроволновым излучением мощностью 800 Вт в течение 1 мин; далее отделяли прозрачный слой экстракта посредством центрифугирования в течение 15 мин при скорости 3 000 об/мин.

Метод приготовления экстракта фруктов с использованием ультразвукового излучения. Навеску измельченных фруктов 1 г (для экстракта концентрацией 0,1 г/см ³ ) помещали в колбу с притертой пробкой, добавляли 10 мл 98%-го этилового спирта, разбавленного водой в соотношении 1 : 1, обрабатывали ультразвуковым излучением мощностью 37 кГц 90 мин при 37 ºС; далее отделяли прозрачный слой экстракта посредством центрифугирования в течение 15 мин при скорости 3 000 об/мин.

Метод определения общего содержания фенольных веществ. Определение фенольных веществ основано на их способности связываться с белковыми веществами, осаждаться солями металлов, окисляться и давать цветные реакции. Исследования проводились по методу, указанному в работе ( Cheng et al., 2013 ). Калькуляцию фенольных соединений осуществляли по калибровочной кривой (мг галловой кислоты на 100 г фруктов, мг ГК/100 г).

Метод определения общего содержания флавоноидов. Содержания флавоноидов определяли по методу ( Cheng et al., 2013 ) с модификацией для экстракта фруктов. Калькуляцию флавоноидов проводили по калибровочной кривой (мг катехина на 100 г фруктов, мг К/100 г).

Метод определения общего содержания антоцианов. Содержание антоцианов в экстрактах фруктов устанавливали спектрофотометрическим методом в экстракте функционального продукта с буферными растворами (показатели рН составили 1,0 и 4,5) ( Cheng et al., 2013 ). Калькуляцию антоцианов проводили по формуле, приведенной в статье ( Cheng et al., 2013 ) (мг цианидин-3-гликозида на 100 г ягод, мг ЦГ/100 г).

Метод определения радикалудерживающей способности ( DPPH-метод ) . Одним из способов оценки антиоксидантной активности является колориметрия свободных радикалов. Данный метод основан на реакции стабильного синтетического радикала DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразила), растворенного в этаноле, с образцом антиоксиданта, содержащегося в экстракте ( Cheng et al., 2013 ). Для анализа антиоксидантной активности применяется параметр Е С50 – концентрация экстракта, при которой происходит 50%-е ингибирование радикала DPPH антиоксидантом экстракта. Торможение реакций окислительного распада происходит тем быстрее и антиоксидантная активность образов тем выше, чем ниже показатель Е _С50 .

Метод определения железосвязывающей активности экстрактов ( FRAP-метод ). Исследование восстанавливающей силы проводили по методу ( Cheng et al., 2013 ), модифицированному для экстракта фруктов. Железосвязывающую активность определяли с помощью калибровочной кривой (ммоль Fe ²⁺ /1 кг фруктов).

Метод оценки антиоксидантных свойств при использовании модельной системы с линолевой кислотой. Данный метод основан на регистрации перокисления линолевой кислоты, которое определяли по реакции веществ, взаимодействующих с радикалом аммония и хлоридом железа (II) при 500 нм и образующихся в процессе нагревания смеси из экстракта фруктов, линолевой кислоты, фосфотного буфера и аддитива Tween-20 при 40 ºС в течение 120 ч (Cheng et al., 2013). Результаты рассчитывали в процентах ингибирования процессов окисления линолевой кислоты.

Опыты проводили в трехкратной повторяемости. Статистическую обработку данных анализа осуществляли с помощью программы MS Excel 2007.

Результаты и обсуждение

Фенольные соединения являются одним из самых известных классов химических веществ растительных систем. В ходе медицинских исследований выявлена биологическая активность представителей этого класса, а также их способность быть профилактическим средством многих заболеваний ( Li et al., 2014 ). Именно по этой причине установление содержания полифенолов играет огромную роль в изучении антиоксидантной активности, так как, по данным многих исследований, эти показатели имеют прямую зависимость. Результаты экспериментального определения общего содержания фенолов в экстрактах фруктов, полученных по трем различным технологиям (рис. 1), позволяют разделить изученные объекты на две группы, характеризующиеся: 1) очень высокими показателями содержания фенолов (черноплодная рябина, брусника); 2) более низкими (малина, вишня, черная смородина). Несомненное преимущество при выборе технологии изготовления экстрактов имеет метод ультразвукового облучения. В порядке убывания показателя общего содержания фенолов все ультразвуковые экстракты можно распределить в такой последовательности: брусника (1378 мг ГК/100 г ИС), черноплодная рябина (1 310 мг ГК/100 г ИС), черная смородина (874 мг ГК/100 г ИС), вишня (858 мг ГК/100 г ИС), черника (821 мг ГК/100 г ИС), малина (730 мг ГК/100 г ИС). При этом метод настаивания является для ряда фруктов более эффективным, чем технология экстрагирования с использованием микроволнового облучения (например, для черноплодной рябины, черники, вишни), тогда как для брусники, малины, черной смородины, наоборот, метод настаивания менее эффективен.

Рис. 1. Результаты определения общего содержания фенолов в экстрактах фруктов, полученных с использованием трех технологий: М – мацерации;

УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки

Fig. 1. The results of determining the total phenol content in fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

Флавоноиды являются классом соединений с высокой биологической активностью, а некоторые их представители успешно используются в фармакологии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (Li et al., 2014). Определение уровня содержания флавоноидов – основная характеристика растительного объекта как потенциального антиоксиданта. Результаты экспериментального установления общего содержания флавоноидов в экстрактах фруктов, полученных по трем различным технологиям, представлены на рис. 2. Следует отметить тот факт, что содержание флавоноидов в объектах может различаться в 4 раза (например, общее содержание флавоноидов в ультразвуковом экстракте черноплодной рябины составляет 442 мг К/100 г ИС, тогда как в ультразвуковом экстракте малины – 92 мг К/100 г ИС). Ультразвуковые экстракты черноплодной рябины (442 мг К/100 г ИС), черники (274 мг К/100 г ИС), брусники (172 мг К/100 г ИС) имеют высокое содержание флавоноидов, а указанные экстракты малины (92 мг К/100 г ИС), черной смородины (101 мг К/100 г ИС), вишни (147 мг К/100 г ИС) – более низкие значения. Как и в случае фенолов, использование ультразвукового облучения при экстракции положительно влияет на уровень флавоноидов, лидерство при выборе технологии экстрагирования переходит к методам микроволновой обработки.

Рис. 2. Результаты определения общего содержания флавоноидов в экстрактах фруктов, полученных с использованием трех технологий: М – мацерации;

УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки

Fig. 2. The results of determining the total content of flavonoids in fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

Антоцианы являются классом веществ, определяющих окраску фруктов и оказывающих профилактическое действие при многих заболеваниях; одним из самых перспективных направлений является профилактика рака ( Li et al., 2014 ). Антоцианы во фруктах также определяют уровень антиоксидантной активности. Однако они крайне чувствительны к воздействию воздуха, температуры, света и т. д. Исследуемые фрукты имеют окраску от малиновой до фиолетово-вишневой. Результаты экспериментального определения общего содержания антоцианов в экстрактах фруктов, полученные по трем различным технологиям, представлены на рис. 3. При экстрагировании наибольшее количество антоцианов выявлено в ультразвуковом экстракте черноплодной рябины (859,76 мг ЦГ/100 г ИС), тогда как содержание этих веществ во всех других объектах находилось приблизительно на одном уровне и значительно уступало их концентрации в черноплодной рябине. Для получения высокого содержания антоцианов технология экстрагирования с использованием ультразвукового облучения является преимущественной, но все же ее отличие от других технологий не столь велико, как при экстрагировании с целью получения повышенной концентрации фенолов и флавоноидов.

Рис. 3. Результаты определения общего содержания антоцианов в экстрактах фруктов, полученных с использованием трех технологий: М – мацерации;

УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки

Fig. 3. The results of determining the total content of anthocyanins in fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

Свободные радикалы – опасный фактор, способствующий разрушению живой клетки или вызывающий ее мутацию ( Li et al., 2014 ). Одним из основных средств борьбы со свободными радикалами являются антиоксиданты ("ловушки радикалов"); именно это свойство контролируется при использовании методики определения антирадикальной активности в ходе взаимодействия со свободным радикалом

2,2’-дифенил-1-пикрилгидразилом. Результаты экспериментального определения антирадикальной активности по методу DPPH в экстрактах фруктов, изготовленных с помощью различных технологий, представлены на рис. 4. Несомненными лидерами по данному показателю являются черноплодная рябина (1,2 мг/мл) и черная смородина (1,6 мг/мл), а лучшей технологией – УЗ-экстрагирование. Но при исследовании брусники технология практически не оказала влияние на уровень полученных результатов.

Рис. 4. Результаты определения антирадикальной активности экстрактов фруктов, полученных с использованием трех технологий: М – мацерации;

УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки

Fig. 4. The results of determining the antiradical activity of fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

Механизм окисления живой клетки в результате оксидативного стресса очень сложен ( Li et al., 2014 ). Одним из вариантов окисления и мутации клетки является окисление липидов клетки, которое интенсивно катализируется ионами металлов. Важным свойством антиоксиданта является его способность ингибировать катализирующее действие ионов металлов. В качестве методики оценки такого действия выступает технология определения восстанавливающей силы (FRAP). Результаты экспериментального определения антиоксидантной активности по методу FRAP в экстрактах фруктов, изготовленных с использованием различных технологий, представлены на рис. 5. Следует отметить, что уровни показателей значительно отличаются. Например, высокие значения имеет несомненный лидер – ультразвуковой экстракт черноплодной рябины (20,70 ммоль Fe ²⁺ /1 кг ИС), низкие - экстракт черной смородины, полученный методом настаивания (6,48 ммоль Fe ²⁺ /1 кг ИС). Для увеличения показателей восстанавливающей силы использование ультразвукового облучения при экстрагировании также весьма целесообразно.

о оо

25,00

20,00

А 15,00 у "

j 10,00

| 5,00

0,00'

Арония Брусника Черника Малина

Вишня

Черная смородина

Рис. 5. Результаты определения по методу FRAP антиоксидантной активности экстрактов фруктов, полученных с использованием трех технологий: М – мацерации;

УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки

Fig. 5. The results of determining antioxidant activity (the FRAP method) of fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

■ М

■ МВ

□ УЗ

Одной из важнейших функций антиоксидантов является способность предотвращать окисление ненасыщенных жирных кислот (Li et al., 2014). Это свойство имеет практическое использование в производстве пищевых продуктов, содержащих жирные кислоты. В настоящее время весьма активно ведутся поиски натуральных антиоксидантов для жиросодержащих пищевых систем. В качестве методики, характеризующей данную способность, предложен метод с использованием линолевой кислоты. Результаты экспериментального определения антиоксидантной активности с применением линолевой кислоты в экстрактах фруктов, полученных по трем различным технологиям, представлены на рис. 6. Некоторые экстракты фруктов имеют очень низкие показатели по ингибированию окисления линолевой кислоты: экстракт черники, изготовленный методом настаивания (12,3 %), экстракт малины, полученный с использованием микроволнового облучения (16,6 %). Экстракты черноплодной рябины и вишни, приготовленные с помощью ультразвукового облучения, являются несомненными лидерами (69,9 и 68,3 % соответственно).

Рис. 6. Результаты определения по методу с использованием линолевой кислоты антиоксидантной активности экстрактов фруктов, полученных по трем технологиям: М – мацерации; УЗ – ультразвуковой обработки; МВ – микроволновой обработки Fig. 6. The results of the determination using the linoleic acid method antioxidant activity of fruit extracts obtained using three technologies: M – maceration; УЗ – ultrasonic treatment; МВ – microwave processing

Заключение

Сравнительный анализ общего содержания фенолов, флавоноидов, антирадикальной активности по методу DPPH, восстанавливающей силы, антиоксидантной активности экстрактов плодов и ягод, приготовленных по трем технологиям (М, МВ, УЗ), показал, что наибольший эффект оказывает ультразвуковой метод, который позволяет увеличить выход активных веществ в получаемых экстрактах до 2,5 раз. Таким образом, установленное в ходе исследования положительное влияние ультразвуковой обработки позволяет рекомендовать ее введение в технологию получения экстрактов с целью увеличения содержания биологически активных веществ.