Влияние температуры на рост психрофильных бактерий, выделенных из пещер Дальнего Востока, Средней Сибири и Западного Кавказа

В настоящее время в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных и пси-хротолерантных микроорганизмов в биотехнологии [10,13–16,18]. Показано, что психрофильные и психро-толерантные микроорганизмы представляют интерес с точки зрения защиты растений [20], биоремедиации почвы и водных объектов в условиях низких температур [11], поиска низкотемпературных ферментов для биотехнологических процессов [10,19].

До сих пор основными источниками психрофильных и психротолерантных изолятов остаются Антарктика и Арктика [9, 21], в отдельных случаях – альпийские почвы [22]. Исследования, проведенные в Красноярском государственном аграрном университете, показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных бактерий и грибов [5, 6]. Было показано, что психрофильные и психротолерантные бактерии сибирских пещер представляют большой практический интерес для сельскохозяйственной биотехнологии, в качестве безопасного для теплокровных биологического средства защиты растений от болезней при низких температурах начала вегетационного периода [2, 3, 7].

Карстовые пещеры, сходные по своим физико-химическим, микроклиматическим и геологическим характеристикам с пещерами Сибири, широко распространены практически по всей территории бывшего Советского Союза. В этой связи представляется актуальным оценить возможность использования карстовых пещер других регионов в качестве источника психрофильных и психротолерантных штаммов бактерий. Ранее было установлено, что психрофильные и психротолерантные бактерии присутствуют не только в пещерах Средней Сибири, но и в пещерах Западного Кавказа [1]. Настоящая работа посвящена сравнительному анализу температурных диапазонов роста психрофильных бактерий, выделенных из пещер различных регионов бывшего СССР.

Объекты и методы. Объектом исследования служили 36 психрофильных и психротолерантных бактериальных изолятов, ранее выделенных нами из микробных сообществ пещеры Сарма (карстовый массив Арабика, Западный Кавказ), пещер Кузнецовская и Лисья (Дальний Восток), и пещер Ледяная, Караульная-2, Женевская, Гондурас (Средняя Сибирь). Суспензии бактериальных клеток из молодых культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста, высевали на агаризованные питательные среды и инкубировали в течение 5…76 часов при различных температурах в диапазоне от плюс 2 до плюс 35ºC. Время генерации (g) бактерий при разной температуре определяли как отношение log 2 среднего числа клеток в микроколониях ко времени культивирования (рис. 1).

Удельную скорость роста (µ) вычисляли как 1/g. Для построения теоретических кривых зависимости скорости роста от температуры использовали типовую модель [8]

v = (b • (T-T) • {I - exp[c • (T - T_max)]})² .

где    T min и T max – соответственно минимальная и максимальная температуры роста;

• µ – удельная скорость роста;

• b и c – константы.

Родовую принадлежность изучаемых изолятов определяли по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК. Секвенирование генов 16S рРНК выполнено в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) и во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).

Были идентифицированы представители следующих родов: Flavobacterium , Janthinobacteriu, Pseudomonas, Pedobacter, Arthrobacter, Sphingopyxis, Pseudochrobactrum, Paenibacillus, Bacillus, Sporosarcina.

Рис. 1. Примеры микроколоний изучаемых изолятов на агаризованных питательных средах

Результаты и их обсуждение. Анализ температурных кривых роста бактерий, выделенных из пещер Кавказа и Дальнего Востока, показал их высокое сходство с аналогичными кривыми бактерий, выделенных из пещер Средней Сибири (рис. 2).

Обращает на себя внимание уход теоретических температурных кривых роста в область отрицательных температур. Ранее подобный феномен был отмечен для бактерий из антарктических и арктических местообитаний [8]. Можно предположить, что это отражает реальную способность ферментативных систем психрофильных бактерий к функционированию при отрицательных температурах. Такое предположение согласуется с зафиксированной в модельных экспериментах микробной активностью в тундровых почвах при температуре до минус 39ºC [17].

В таблице представлены обобщенные данные по температурным характеристикам бактерий, выделенных из изучаемых сообществ.

Рис. 2. Типичные температурные кривые роста психрофильных бактерий, выделенных из пещер Средней Сибири (на примере штамма Ж1), Кавказа (на примере штамма Срм1), Дальнего Востока (на примере штамма В1.3)

Температурные характеристики психрофильных бактерий, выделенных из изучаемых сообществ

Следует отметить сходство температурных характеристик бактерий, выделенных из географически удаленных пещер. Указанное сходство можно объяснить сходством экологических условий в данных пещерах. Все пещеры залегают в известняках, характеризуются постоянной температурой, близкой к плюс 4ºC, и одинаковой стадией геологического развития (водно-галерейная, сухо-галерейная и грото-камерная стадии спелеогенеза). В этой связи следует ожидать одинаковой направленности эволюционных процессов в микробных сообществах этих пещерах.

В то же время таксономический состав психрофильных бактерий в изучаемых сообществах различается. Так, в сообществах сибирских пещер широко представлены спорообразующие бактерии р. Bacillus , Paenibacillus , Sporosarcina , которые в сумме составляют 40% изолятов, в то время как в сообществах пещер Кавказа и Дальнего Востока психрофильные спорообразующие бактерии не выявлены. В то же время в пещере Сарма присутствуют психрофильные представители р. Sphingopyxis , не обнаруженные в пещерах Средней Сибири и Дальнего Востока. Психрофильные представители р. Pseudomonas и Arthrobacter обнаружены во всех изучаемых пещерах. Однако если психрофильные бактерии р. Pseudomonas , выделенные в пещерах Сибири, Дальнего Востока и Кавказа, демонстрируют сходство по гену 16S рРНК с одним и тем же набором видов ( Pseudomonas jessenii , P. moorei , P. fragi ), то спектр бактерий р. Arthrobacter в пещерах разных регионов различается. Так, для представителей данного рода, выделенных из пещер Сибири, характерно сходство с недавно описанным антарктическим видом Arthrobacter antarcticus . В то же время выделенные из пещер Дальнего Востока изоляты р. Arthrobacter генетически близки к почвенному виду A. globiformis , а выделенные из пещеры Сарма – к недавно описанному альпийскому виду A. alpinus . Отмеченные различия в таксономическом составе психрофильных бактерий в пещерных сообществах разных регионов согласуются с предположением о том, что сообщества пещер формируются на основе местной почвенной и водной микробиоты, проникающей в пещеры и адаптирующейся к низкотемпературным условиям подземной полости [4,7].

Выводы

• 1.    В карстовых пещерах Западного Кавказа и Дальнего Востока присутствуют психрофильные и пси-хротолерантные бактерии, аналогичные по своим температурным кривым роста бактериям, выделяемым из пещер Средней Сибири.

• 2.    Таксономический состав бактерий в пещерных микробных сообществах Дальнего Востока, Средней Сибири и Западного Кавказа различается.

• 3.    Карстовые пещеры Дальнего Востока и Западного Кавказа, наряду с пещерами Средней Сибири, могут служить источником психрофильных и психротолерантных бактериальных штаммов для осуществления низкотемпературных биотехнологических процессов.