Влияние температуры на скорость роста амилолитических штаммов Geomyces pannorum

Введение. Амилазы микробного происхождения широко используются в бродильном, крахмало-паточном, текстильном и бумажном производствах, в производстве глюкозы и органических кислот в качестве биодобавок в моющие средства [4]. Показан положительный эффект от использования микробных амилаз для повышения усвояемости крахмалсодержащих кормов в животноводстве [6, 9]. В последние годы наблюдается рост использования амилаз для производства ферментативно-модифицированного крахмала, используемого в продуктах питания в качестве заменителя жира и улучшителя консистенции [3]. По современным оценкам, микробные амилазы занимают около 25 % мирового рынка ферментов [4]. До недавнего времени в промышленности и сельском хозяйстве применялись главным образом терм о ф ильные амилазы c температурными опти-мумами 70–90 °C, однако в последние годы в мире наблюдается стремительно растущий интерес к средне- и низкотемпературным амилазам с оптимумом от 50–60 °C и ниже [5, 8]. В то же время низкотемпературные амилазы отечественного производства представлены на рынке лишь одним препаратом – АмилоЛюкс-А, производитель ООО ПО «Сиббиофарм», штамм-продуцент – мицелиальный гриб Aspergillus awamori . Для расширения номенклатуры низкотемпературных амилолитических препаратов настоятельно необходим поиск новых продуцентов. Поиск продуцентов низкотемпературных ферментов традиционно ведется среди псих-рофильных и психротолерантных микроорганизмов. Ранее нами было показано, что выделяемые из холодных карстовых пещер психро-фильные и психротолерантные грибы р. Geomyces имеют хороший потенциал в качестве возможных продуцентов низкотемпературных амилаз [2].

Цель исследования : изучение влияния температуры на рост пещерных изолятов Geomyces pannorum с точки зрения перспектив их практического использования в производстве низкотемпературных амилолитических ферментов.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили амилолитические изоляты мицелиальных грибов G. pannorum , выделенные из грунта известняковой карстовой пещеры «Караульная-2» (Красноярский край,

Емельяновский район, Карауленский спелеоучасток Приенисейской складчато-блоковой зоны). Протяженность пещеры составляет 540 м, глубина – 34 м, температура грунта – от +2,8 до +4,0 °С в зависимости от удаленности от входа, относительная влажность воздуха – около 95 %.

Выделение амилолитических изолятов проводили методом рассева из суспензий грунта на среде следующего состава, г/л: крахмал – 10,0; NH4NO3 – 2,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4·7H2O – 0,5; KCl – 0,5; FeSO4 – следовые количества; агар микробиологический – 20,0; рН = 6,5–7,0. Температура инкубации составляла +8 °C. Наличие амилолитической активности проверяли по выявляемой раствором Люголя зоне гидролиза крахмала вокруг колонии (рис. 1).

Рис. 1. Зоны гидролиза крахмала вокруг колоний G. pannorum

Видовую идентификацию проводили по культурально-морфологическим признакам по [1].

Влияние температуры на скорость роста штаммов изучали путем высева конидий на ПД-агар (пептон ферментативный – 9,0 г/л; гидролизат казеина ферментативный – 8,0; дрожжевой экстракт – 3,0; NaCl – 5,0; Na2HPO4 – 2,0; агар – 20,0 г/л; pH=7,0–7,2) с последующим параллельным культивированием при различных температурах: +9, +15, +21, +27 и +30 °C. Скорость роста при каждой температуре (мкм/ч) определяли по изменению средней длины про-ростковой гифы за интервал времени. Первое измерение проводили после прорастания конидий, второе – через 12 ч для температуры +9 °C, и через 7–9 ч для остальных температур. Измерение проводили по микрофотографиям с использованием бесплатной программы ImageJ, в каждом случае измеряли по 15–30 гиф. Масштабный коэффициент для пересчета результатов измерений в микрометры определяли с помощью объект-микрометра проходящего света ОМП ГОСТ 7513-55 производства ОАО «ЛО-МО». В качестве теоретической модели зависимости скорости роста от температуры использовали модель Ratkowsky et al. [7].

A = ( b . ( T - T^) ■ (1 - e c^T T- > ))² , (1)

где µ – скорость роста; T – температура; T max и T min – соответственно максимальная и минимальная температуры роста; b и c – коэффициенты.

Коэффициенты в моделях для каждого штамма определяли по экспериментальным данным методом наименьших квадратов с использованием пакета Stat Soft STATISTICA 6.0, модуль «Нелинейная оценка/Пользовательская регрессия». Полученные модели использовали для определения теоретических оптимальных температур роста и скоростей роста при оптимальной температуре. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа «Микмед 6» (вар. 3), оснащенного цифровой камерой DCM-130E.

Результаты исследования. В общей сложности выделено и изучено 8 амилолитических штаммов, относящихся к виду G. pannorum. Верхний температурный предел роста у всех штаммов близок к +30 °C, температурные опти- мумы варьируют в диапазоне от 18,5 до 25,3 °C при среднем значении 22,2 °C. Скорость роста гифы на ПД-агаре при оптимальной температуре варьирует от 4,2 до 17,5 мкм/час на одну точку роста при среднем значении 10,2 мкм/ч.

Не выявлено связи между температурным оптимумом и скоростью роста штаммов при оптимальной температуре: соответствующий коэффициент корреляции r = 0,205, его статистическая значимость p = 0,627 (рис. 2).

В большинстве случаев зависимость скорости роста от температуры адекватно описывается моделью Ratkowsky et al. с коэффициентами детерминации R2 от 0,987 до 0,999 (рис. 3). Однако для ряда штаммов температурные кривые отличаются от модели Ratkowsky et al. и требуют модификации модели путем возведения уравнения (1) в степень (рис. 4).

В подобных случаях для нахождения реального температурного оптимума необходимо проводить дополнительные эксперименты вблизи предполагаемого экстремума (рис. 5).

on 20
18 о 16 14 12 S 10 8 °" s 6 S. 4 . 4 2	♦
0 1	7           19           21           23           25           2 Оптимальная температура, ºС	7

Рис. 2. Соотношение температурного оптимума и скорости роста гифы при оптимальной температуре у исследуемых штаммов

Рис. 3. Экспериментальные и теоретические (рассчитанные по модели Ratkowsky et al.) значения скорости роста G. pannorum в зависимости от температуры на примере штамма 4.

Коэффициент детерминации R2=0,998

^^^мТеоретические значения о Усреднённые экспериментальные значения

Рис. 4. Экспериментальные и теоретические значения скорости роста G. pannorum в зависимости от температуры на примере штамма G1. Для построения теоретической кривой использована 3-я степень уравнения (1). Коэффициент детерминации R2=0,981

Температура, oС

Температура, oС

Рис. 5. Экспериментальные значения скорости роста G. pannorum в зависимости от температуры вблизи температурных оптимумов для штаммов, у которых температурная зависимость отличается от модели Ratkowsky et al.

В большинстве случаев температурные кривые роста имеют асимметричный вид, при котором температурный оптимум лежит вблизи температурного максимума. Данное явление является классическим для микробных культур [7]. Одна- ко для одного штамма температурная кривая близка к параболе, хотя и для этого случая модель Ratkowsky et al. является адекватной (рис. 6).

^^^^мТеоретические значения о Усреднённые экспериментальные значения

Рис. 6. Экспериментальные и теоретические (рассчитанные по модели Ratkowsky et al.) значения скорости роста G. pannorum в зависимости от температуры на примере штамма 3.

Коэффициент детерминации R2=0,987[2]

Заключение. Можно констатировать, что все выделенные из пещеры амилолитические штаммы G. pannorum по своим температурным кривым роста могут быть отнесены к психрото-лерантным либо (в связи с размытостью границ между определениями «психрофильный» и «психротолерантный») к умеренно-психро-фильным. Температурные оптимумы лежат в диапазоне, позволяющем осуществлять процесс культивирования для наработки ферментов при температуре 20–22 °C, что примерно на 15 °C ниже температуры, рекомендованной для A. awamori и других промышленных штаммов грибов-продуцентов гидролитических ферментов. Это позволяет существенно снизить энергозатраты за счет отсутствия необходимости подогрева питательной среды.