Влияние теплового закаливания на углеводный обмен проростков пшеницы и фасоли при адаптации к гипертермии

Высокотемпературный стрессор представляет собой один из самых значимых абиотических факторов, оказывающих существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов, рост и продуктивность растений.

Важная роль углеводного обмена для процессов адаптации растений к температурным воздействиям в настоящее время не вызывает сомнения. Однако направленность превращений углеводноферментного комплекса в условиях стресса, в том числе и температурного, до настоящего времени остается предметом дискуссии. Одни авторы счи- тают, что это результат деструктивных процессов, связанных с повреждением клеток в условиях стресса, другие – одной из составляющих комплекса защитных реакций на стресс [Колупаев, Трунова, 1992; Титов, Таланова, 2009]. Следует отметить, что наибольшее количество экспериментальных данных по углеводному обмену получено при изучении гипотермии. В то же время исследованию роли данного обмена в формировании теплоустойчивости уделялось значительно меньше внимания. Особенно мало работ по физиологобиохимическим основам теплового закаливания, по результатам которых известно, что тепловое закаливание представляет собой сложный многокомпонентный кооперативный процесс, в который

вовлечены как специфические, так и неспецифические изменения [Шакирова, 2001]. Поскольку многие авторы считают, что усиление гидролиза полимерных форм углеводов, в том числе и низкомолекулярных олигосахаридов, является неспецифической ответной реакцией растений на неблагоприятные воздействия различной природы (холодовой, тепловой, осмотический, солевой и др.) [Карпец, Колупаев, 2009; Чудинова, Суворов, 2011], то можно предполагать участие углевод-ферментного комплекса в развитии теплоустойчивости при закаливании. В этом плане большой интерес представляют гидролитические ферменты, играющие важную роль в углеводном метаболизме, в частности, амилаза и инвертаза. Однако на сегодняшний день отсутствуют четкие экспериментальные доказательства связи активности данных ферментов с формированием устойчивости растений к гипертермии после закаливания.

В связи с вышеизложенным, цель нашей работы – изучение влияния теплового закаливания на содержание растворимых углеводов и активность ключевых гидролитических ферментов углеводного обмена в проростках пшеницы и фасоли в процессе их адаптации к последующей гипертермии.

Объекты и методы исследований

Проростки пшеницы мягкой ( Triticum аestivum L.), сорт ‘Иргина’, и фасоли спаржевой ( Phaseolus nanus L.), сорт ‘Журавушка’, выращивали 10 сут. в климатической камере ШН-М на смеси вермикулита и песка в соотношении 1:1 при температуре 22°C, влажности 80–85% и освещенности люминесцентными лампами 18 ч. в сут. Затем эксперимент в течение 3 сут. проводили по следующей схеме:

• 1    вариант – экспозиция проростков при +22°C (контроль);

• 2    вариант – экспозиция проростков при +40°С (гипертермия);

• 3    вариант – экспозиция при +40°С с предобработкой +37°С 3 ч. (тепловое закаливание).

Для анализа растения брали на 1-е и 3-и сут. адаптации. Побеги фиксировали паром в течение 5 мин. и досушивали до воздушно-сухого состояния. Определяли содержание глюкозы и сахарозы фотометрическим методом [Большой практикум …, 2012]. Суммарную активность амилаз определяли по степени гидролиза крахмала, активность инвертазы – по накопленной в пробе глюкозы.

Повторность определений – 3-кратная. Результаты обрабатывали статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Определяли достоверность различий между некоторыми вариантами по наименьшей существенной разнице (НСР 0,05 ).

Результаты и их обсуждение

Полученные нами результаты (рис.1, А, Б) показали, что исходный статус глюкозы (контроль) у проростков пшеницы был намного выше, чем у проростков фасоли. Это согласуется с мнением ряда авторов о том, что злаки в целом являются растениями с углеводным типом обмена веществ, тогда как бобовые – с белковым типом [Строгонов, 1962].

Содержание глюкозы в проростках пшеницы при гипертермии на 1-е сут. экспозиции сохранялось на уровне контроля, тогда как на 3-и сут. – незначительно снижалось. Тепловое закаливание достоверно стимулировало накопление глюкозы на 3-и сут. адаптации проростков пшеницы к гипертермии (рис. 1, А).

Иная тенденция прослеживалась в проростках фасоли (рис. 1, Б). Так, во всех опытных вариантах при 1-суточной экспозиции наблюдались незначительные колебания содержания глюкозы в сравнении с контролем, тогда как на 3-и сут. адаптации к гипертермии отмечалось достоверное накопление глюкозы, которое сохранялось и в варианте с предварительным закаливанием.

Рис. 1 . Изменение содержания глюкозы в проростках пшеницы (А) и фасоли (Б) при гипертермии без теплового закаливания и после него:

Здесь и далее: 1 вариант – контроль; 2 вариант – гипертермия (+40 ° C); 3 вариант - тепловое закаливание (+37 ° C, 3 ч) и последующая гипертермия (+40 ° C)

Таким образом, в целом, для пшеницы и фасоли характерен довольно стабильный или повышенный уровень глюкозы при гипертермии на 3-и сут. адаптации без закаливания и, особенно, с предварительным тепловым закаливанием. По мнению рядя авторов, повышенное содержание глюкозы можно считать защитно-приспособительной реакцией на стрессор [Дерябин и др., 2007]. Аналогичное предположение было выдвинуто и в отношении сахарозы, поскольку зафиксировано увеличение ее содержания и изменение изоферментного спектра в ответ на стрессы самой различной природы – гипертермию, засоление, обезвоживание, раневые воздействия, заражение патогенном [Колупаев, Трунова, 1992].

Мы наблюдали снижение содержания сахарозы в проростках пшеницы на 1-е и 3-и сут. адаптации при воздействии гипертермии (рис. 2, А) и заметное увеличение в условиях предварительного теплового закаливании (на 35% по отношению к контролю и в 2.8 раза по сравнению с вариантом без закаливания).

Рис. 2. Изменение содержания сахарозы в проростках пшеницы (А) и фасоли (Б) при гипертермии без теплового закаливания и после него

В проростках фасоли при 1-суточном воздействии гипертермии количество сахарозы оставалось на уровне контроля, а через 3-е сут. экспозиции – резко снижалось по сравнению с контролем (рис. 2, Б). Предварительное тепловое закаливание стимулировало накопление сахарозы у фасоли, что говорит о включении механизмов адаптации.

Механизмы защитного действия растворимых углеводов в растениях при действии стрессоров могут быть достаточно разнообразны. Так, показано их активное участие в «тушении» окислитель- ного стресса, вызванного гипертермией, антиденатурирующее действие на белково-липидный комплекс мембран, стабилизация белковых компонентов клеток, подвергнутых нагреву. Наконец, сахара могут неспецифически ингибировать метаболизм вследствие адсорбции на поверхности макромолекул ферментов и таким образом препятствовать конформационным изменениям, необходимым для осуществления катализа [Колупаев, Трунова, 1992; Кафи, Стюарт, Борланд, 2003; Карпец, Колупаев, 2009].

Содержание растворимых сахаров в значительной степени определяется активностью гидролитических ферментов – инвертазы и амилазы, которая изменяется в условиях воздействия стрессоров различной природы [Трунова, 2007].

Инвертаза, катализирующая реакцию расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу, обеспечивает гексозами энергетические процессы, вовлечена в разгрузку флоэмы, играет ключевую роль в процессах роста и развития [Даффус, Даффус, 1987].

Полученные нами результаты показали (рис. 3, А), что активность инвертазы контрольных растений пшеницы снижалась на 3-и сут. в 2.3 раза, что свидетельствует о загрузке флоэмы сахарозой. В условиях воздействия гипертермии без теплового закаливания и, особенно, с предварительным закаливанием активность инвертазы пшеницы была достоверно ниже контроля. Поскольку в надземной части проростков пшеницы одновременно с пониженной активностью инвертазы наблюдалось и снижение содержания сахарозы, то можно говорить о преобладании транспорта сахарозы по флоэме в корневую часть растения в условиях действия гипертермии.

В проростках фасоли (рис. 3, Б) активность инвертазы во всех вариантах была на низком уровне. Исключение – в варианте с предварительным закаливанием, где активность инвертазы резко возрастала на 3-и сут. адаптации к гипертермии. Можно предположить, что в данном случае происходит интенсивный гидролиз сахарозы, который служит механизмом накопления глюкозы.

Данные, имеющиеся в литературе, об изменении активности инвертазы после температурного воздействия – противоречивы. Так, одни авторы отмечают усиление активности этого фермента [Дерябин и др., 2007], а другие – снижение [Кси-шев, 1992]. Одной из причин расхождения результатов о характере ответной реакции инвертазы на стрессы может быть различное поведение фермента в зависимости от напряженности и продолжительности стресса. Известно, что изменение активности инвертазы при воздействии стрессора может происходить за счет изменения количества фермента в ткани, преобразования изоферментного состава, регуляции каталитической активности уже существующих молекул фермента, изменения активности фермента вследствие взаимного перехода его растворимой и связанной с клеточными стенками форм [Сабельникова, 2007].

Рис. 3 . Изменение активности инвертазы в проростках пшеницы (А) и фасоли (Б) при гипертермии без теплового закаливания и после него

В наших исследованиях низкая активность инвертазы и следовые количества сахарозы у растений фасоли при гипертермии указывают на процессы загрузки флоэмы и транспорта сахарозы в корни. Апопластный способ загрузки флоэмы и подавление активности кислой инвертазы в растениях делает возможным отток сахаров из листьев, что позволяет обеспечивать сахарами корневую систему. Показано [Попов, 2002], что процессы оттока сахаров из листьев в корни играют значительную роль в адаптации теплолюбивых растений к низким положительным температурам.

Как известно, амилолитическая активность определяет уровень пластидного крахмала, а также крахмала амилопластов, выполняющих роль своеобразного депо глюкозы [Даффус, Даффус, 1987]. Нами установлено достоверное увеличение активности амилазы в проростках пшеницы на 3-и сут. действия повреждающей температуры по отношению к контролю (рис. 4, А). При предварительном закаливании активность амилазы была существенно пониженной в оба срока определения в сравнении с контролем, а также с вариантом – гипертермия без закаливания.

В проростках фасоли было отмечено снижение активности амилазы в побегах опытных вариантах на 3-и сут. экспозиции по сравнению с контролем

(рис.4, Б). Можно предположить, что благодаря закаливанию, в проростках фасоли происходит восстановление фотосинтетических процессов.

Рис. 4. Изменение активности амилазы в проростках пшеницы (А) и фасоли (Б) при гипертермии без теплового закаливания и после него

На основании полученных нами результатов можно сделать следующие основные выводы:

Адаптация к гипертермии проростков пшеницы и фасоли сопровождается ростом уровня глюкозы, что происходит, предположительно, за счет повышения интенсивности фотосинтеза, а не за счет амилолиза. На это указывает снижение активности амилазы в этих условиях. Выявленный при этом низкий уровень сахарозы и активности инвертазы указывает на активную загрузку флоэмы и отток сахаров из листьев, что позволяет обеспечивать сахарами корневую систему в условиях температурного стресса.

Предварительное тепловое закаливание приводит к значительному росту количества глюкозы и сахарозы у обоих растений в условиях последующей гипертермии. При этом амилазная активность оставалась ингибированной, тогда как инвертазная активность была низкой у пшеницы, у фасоли она значительно возрастала. Это позволяет предположить, что в основе теплового закаливания обеих культур лежит повышенный уровень растворимых сахаров, который достигается у них разными механизмами: у пшеницы – за счет повышенной ин- тенсивности фотосинтеза, а у фасоли – за счет торможения оттока сахарозы во флоэму.