Влияние тербуталина сульфата и модуляторов сигнальных путей на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

• ^а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

• ^ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Установлено, что в системе in vitro тербуталина сульфат (10"⁶ М) угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. Сходное воздействие оказывает теофиллин (3 мМ). Инкубация нейтрофилов с верапамилом гидрохлоридом (0,025 мг/мл) стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов. Показано, что литий оксибутират (1,5 мг/мл) не оказывает влияния на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.

Адренергические соединения являются важнейшими факторами нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы при различных физиологических и патологических состояниях (Абрамов, 1988; Корнева, Шхинек, 1988; Крыжанов-ский и др., 1997; DelRey et al., 2002; Sanders, Straub, 2002). Направленность регуляторных эффектов катехоламинов на функцию фагоцитирующих клеток зависит от уровня экспрессии того или иного типа специфических рецепторов, причем ранее показано разнонаправленное влияние стимуляции разных типов адренорецепторов на функциональную активность клеток (Шилов, Ланин, 2001; Spengler et al., 1994; Shilov, Orlova, 2003). Основными внутриклеточными посредниками, реализующими эффекты адренергических соединений на молекулярном уровне, являются циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), продукты метаболизма фосфатидилинозитола и ионы кальция, которые через специфические протеинкиназы определяют процесс фосфорилирования соответствующих факторов транскрипции и реализацию биологических эффектов (Elenkov et al., 2000). Однако направленность изменений интегральных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов в условиях фармакологической модуляции указанных сигнальных путей изучена недостаточно.

Цель настоящей работы - анализ воздействия Р-адренергического агониста тербуталина сульфата и модуляторов сигнальных путей на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови крыс в эксперименте in vitro.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 60 крысах-самцах популяции Wistar массой 188,7±6,5 г. Образцы периферической крови получали из сосудов хвоста интактных животных. Влияние Р-адренергического агониста тербуталина сульфата (10"⁶ М), лития оксибутирата (1,5 мг/мл, ингибитор инозитол-1-монофосфатазы), теофиллина (3 мМ, ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ) и верапамила гидрохлорида (0,025 мг/мл, блокатор "медленных", потенциалне-зависимых кальциевых каналов) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали в системе in vitro. При выборе концентраций ориентировались на ранее опубликованные данные (Ярилин, 1985; Ширшев, Кеворков, 1993; Шилов, Шилов, 2001). Работу проводили на забуфе-ренной питательной среде, приготовленной на среде 199 с добавлением 10 mM HEPES и 2 mM A-глутамина. В опытных пробах клетки гепаринизированной крови (50 ЕД/мл) преинкубировали с вышеупомянутыми препаратами в соответствующей концентрации в течение 1 ч при 37°С. В контрольные пробы вместо препаратов вносили такое же количество забуференной питательной среды. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови исследовали по отношению к формалинизированным эритроцитам барана по ранее описанному методу (Каплин, 1996; Шилов и др., 1998).

Статистическую достоверность различий оценивали по парному t-критерию Стьюдента, знаковому Т-критерию Вилкоксона.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что у интактных животных преимущественная стимуляция Р-адренорецепторов при добавлении p-адренергического агониста тербуталина сульфата угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов как по относительным, так и по абсолютным показателям (табл. 1). При моделировании эффекта стимуляции Р-адренорецепторов добавлением теофиллина - блокатора фосфодиэстеразы, повышающего уровень цАМФ, также выявлено угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов как по относительным, так и по абсолютным показателям (табл. 2). По данным литературы (Au et al., 1998), внесение других цАМФ-повышающих агентов, таких как простагландин Е2 и дибутирил-цАМФ, также оказывает супрессивное влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов. Таким образом, угнетающее действие адренергических соединений на фагоцитарную активность нейтрофилов может реализоваться через р-адренорецепторы и повышение уровня внутриклеточного цАМФ.

Таблица 1 Влияние тербуталина сульфата (10б М) in vitro на показатели фагоцитарной активности ней трофилов периферической крови крыс

Примечание. Здесь и в табл. 2 Т - р<0,05 в сравнении с показателями контроля по Т-критерию Вилкоксо-на, t - р<0,05 в сравнении с показателями контроля по парному «-критерию Стьюдента.

Ранее в наших работах было показано, что преимущественная стимуляция адренергическими соединениями «-адренорецепторов при остром им-мобилизационном стрессе повышает фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс, поскольку введение p-адреноблокатора пропранолола усиливает активирующее влияние стресса на функции фагоцитирующих клеток (Shilov, Orlova, 2003). Известно, что трансдукция сигнала через «1-адренорецепторы реализуется при участии фосфатидилинозитольного сигнального пути, а «2-адренорецепторов - за счет снижения концентрации внутриклеточного цАМФ (Elenkov et al., 2000). В связи с этим в данной работе проанализированы эффекты модуляторов вышеуказанных сигнальных путей. Установлено, что блокада метаболизма фосфатидилинозитола литием оксибутиратом в эксперименте in vitro не влияет на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов (табл. 2). По-видимому, активирующее влияние катехоламинов на фагоцитарную активность нейтрофилов реализуется преимущественно через снижение уровня цАМФ при участии «2-адренорецепторов.

Таблица 2

Влияние теофиллина (3 мМ), верапамила гидрохлорида (0,025 мг/мл), лития оксибутирата

• (1,5 мг/мл) in vitro на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови крыс

  Показатели	Контроль (преинкубация со средой)	Теофиллин	Верапамила гидрохлорид	Литий оксибутират
  Фагоцитарное число	1,001 0,10	0,811 0,07	1,211 0,09*	0,931 0,12
  Фагоцитарный индекс	2,091 0,08	1,841 0,08 ‘	2,091 0,07	1,891 0,1
  Процент фагоцитоза	46,241 3,20	43,471 2,57	56,51 2,54*	46,751 3,61
  Абс. число объектов	27051 814	21611 622т	3325+ 875т	27691 903
  Абс. число фагоцитирующих нейтрофилов	12401 304 ■	1181+ 274	14651 298т	13171 319

  Известно, что необходимым условием осуществления фагоцитоза является реорганизация цитоскелета клетки при участии ионов кальция, выброс которых осуществляется также при взаимодействии объектов фагоцитоза с рецепторами фагоцита (Е1-ferink, deKoster, 2000; Stone et al., 2000). Увеличение

  уровня внутриклеточного кальция связано с его поступлением как извне, через "медленные", потенци-алнезависимые кальциевые каналы, так и из эндоплазматического ретикулума. Установлено, что блокада "медленных", потенциалнезависимых кальциевых каналов при инкубации с верапамилом стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов (табл. 2). Этот эффект является несколько необычным, так как снижение уровня кальция, по данным большинства исследователей, должно приводить к угнетению функций фагоцитирующих клеток. Ранее было показано, что, хотя блокаторы кальциевых каналов снижают продукцию активных форм кислорода и провоспалительных цитокинов (Stone et al., 2000), повышение уровня кальция тапсигаргином (специфическим препаратом, высвобождающим его из внутриклеточных депо) приводит к угнетению хемотаксиса человеческих нейтрофилов, индуцированного интерлейкином-8 (Elferink et al, 2000). Блокаторы кальциевых каналов (верапамил, эконазол) действовали в этой тест-системе прямо противоположно, т. е. активировали хемотаксис. По данным литературы (Stone et al., 2000), блокада кальциевых каналов может приводить не только к снижению концентрации внутриклеточного кальция за счет торможения его поступления в клетку извне, но и,

напротив, к увеличению его уровня за счет высвобождения из эндоплазматической сети по механизмам обратных связей. К сожалению, в доступной литературе не удалось найти данных о влиянии блокаторов кальциевых каналов именно на фагоцитарную, в узком смысле термина, или поглотительную активность изучаемых клеток. Таким образом, выявленная стимуляция фагоцитарной активности нейтрофилов в условиях блокады кальциевых каналов может быть опосредована компенсаторным выбросом ионов кальция из внутриклеточных депо в ответ на взаимодействие клетки с объектом фагоцитоза.

Выводы        .

• 1.    Установлено, что в системе in vitro Р-адре-нергический агонист тербуталина сульфат (10"⁶ М) угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. Сходные эффекты оказывает модулятор цАМФ-зависимых путей теофиллин (3 мМ).

• 2.    Показано, что инкубация нейтрофилов с блокатором кальциевых каналов верапамилом гидрохлоридом (0,025 мг/мл) стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов. Литий оксибутират (1,5 мг/мл) не оказывает влияния на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.