Влияние тяжелых металлов на штаммы рода Enterococcus

Тяжелые металлы являются естественными компонентами морской и пресноводной среды и обычно встречаются в очень низких концентрациях [Shah, 2021]. Природные процессы, способствующие распространению этих металлов в окружающей среде, включают эрозию, извержения вулканов и выветривание полезных ископаемых, при этом они обычно находятся в нерастворимых формах [Ayangbenro, Babalola, 2017].

Антропогенная деятельность, такая как дренаж шахт, морская разведка нефти и газа, промышленные (пестициды, краски, кожа, текстиль, удобрения, фармацевтические препараты) и бытовые сточные воды, сельскохозяйственные стоки, сбросы кислотных дождей, а также прибрежное строительство и дноуглубительные работы, неизбежно увеличили концентрации металлов в морской среде [Fu, Wang, 2011]. Тяжелые металлы из антропогенных источников обычно имеют высокую биодоступность благодаря своим растворимым и подвижным реакционноспособным формам [Ayangbenro, Babalola, 2017].

Энтерококки – это представители нормальной микрофлоры кишечника человека и животных, но также они могут выделяться из носоглотки, верхних дыхательных путей, мочеполовой системы и кожных покровов [Barbosa, Borges, Teixeira, 2014]. Ранее считалось, что микроорганизмы рода Enterococcus являются эпидемиологически малозначимыми, т.к. достаточно редко регистрировались микробиологически подтвержденные клинические случаи энтерококковых инфекций. Однако данная точка зрения была пересмотрена, поскольку у бактерий данной группы были обнаружены факторы вирулентности и оценена их активность [Красная, Нестеров, Потатуркина-Нестерова, 2014]. Патогенность представителей рода Enterococcus обусловлена их чувствительностью к антибиотикам и наличием детерминант патогенности в генетической информации. Наиболее распространенными видами в этой группе являются E. faecalis и E. faecium , причем E. faecalis встречается чаще. Соотношение этих микроорганизмов в водной среде зависит от экологических условий. В микробиоценозе могут присутствовать и другие виды рода Enterococcus . E. faecalis – более патогенен, чем E. faecium , однако последний обладает большей устойчивостью к антибиотикам [Butaye, Devriese, Haesebrouck, 2001]. Такие представители энтерококков, как Enterococcus durans , Enterococcus avium , Enterococcus gallinarum и Enterococcus casseliflavus, проявляют патогенные свойства лишь в единичных случаях [Sadowy, Luczkiewicz, 2014].

Несмотря на то, что энтерококки могут выживать как в пресной, так и в морской воде, до сих пор нет единого мнения относительно их способности расти и размножаться в этих средах из-за нехватки питательных веществ [Cesare et al., 2014]. Несмотря на это, энтерококки могут быть выделены из множества условий окружающей среды с различной доступностью питательных веществ, таких как почва, пресная вода, пляжи и очистные сооружения [Красная, Нестеров, Потатуркина-Нестерова, 2014]. Сточные воды, не прошедшие должную очистку, могут стать источником загрязнения как поверхностных, так и подземных вод, что представляет собой серьезную угрозу для окружающей среды. Это может произойти вследствие неэффективности систем очистки сточных вод, а также из-за неполадок или перегруженности систем водоотведения. Кроме того, сточные воды могут содержать отходы животноводства, которые, попадая на сушу или в водоемы, создают угрозу для людей, которые могут случайно употребить загрязненную воду или вступить с ней в контакт в повседневной жизни [Burgmann et. al., 2018].

В более новых исследованиях, в особенности с применением молекулярно-генетических методов, была подтверждена способность микроорганизмов рода Enterococcus приобретать устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам, а также к высушиванию, температуре и действию других физических, химических и биологических факторов [Gin, Goh, 2013]. Данная особенность позволяет им выживать в желудочно-кишечном тракте и колонизировать толстый кишечник, также их выделяют с кожи, ротовой полости и женского мочеполового тракта [Barbosa, Borges, Teixeira, 2014]. Попадая в окружающую среду, они могут некоторое время сохраняться в жизнеспособном, но некультивируемом состоянии [Gin, Goh, 2013], а в некоторых местах, например таких, как морская вода, они могут обмениваться генами устойчивости к антибиотикам и металлам с другими бактериями [Cesare et al, 2014].

Тяжелые металлы, такие как медь и цинк, являются кофакторами многих клеточных процессов и необходимы для выживания клеток, но они нужны в небольших концентрациях [Arguello, Raimunda, Padilla-Benavides, 2013]. Однако такой тяжелый металл, как кадмий, не выполняет функции кофактора в бактериальной клетке и по своей природе токсичен, нарушая клеточные процессы и вызывая гибель клеток, если концентрация выше определенного порога [Arguello, Raimunda, Padilla-Benavides, 2013; Parsons, Lee, Kathariou, 2020].

Медь является важным микроэлементом в клетках и выполняет несколько биологических функций. Она служит значимым структурным компонентом и каталитическим кофактором для широкого спектра различных ферментов в важных биохимических путях у бактерий, растений и животных [Zhang et al., 2015]. Сульфат меди используется в кормах для свиней и кур в качестве стимулятора роста. [Garrido, Galvez, Pulido, 2014]. Ген tcrB , расположенный в плазмиде, отвечает за устойчивость к меди. Ген trcB (обнаруженный в опероне tcrYAZB, гомологичный оперону copYAZAB, определяющий гомеостаз меди)

кодирует предполагаемый белок, принадлежащий к семейству АТФаз CPx-типа переносчиков тяжелых металлов. Бактерии, несущие плазмидный оперон tcrYAZB, могут переносить до 28 мМ сульфата меди, в то время как те, у которых отсутствует этот ген, могут переносить только до 8 мМ [Hasman, Aarestrup, 2002]. Ген tcrB генетически связан с генами, кодирующими устойчивость к макролидам ( erm B ) и гликопептидам ( vanA ) в плазмидах, из энтерококков, выделенных от свиней [Garrido, Galvez, Pulido, 2014].

Цинк является компонентом многих белков, таких как ДНК-полимеразы, протеазы и рибосомальные белки, а также кофактором многих ферментативных реакций. Несмотря на важность цинка, его избыток может быть вредным, поскольку он может конкурировать с другими металлами за связывание с активными центрами ферментов [Somerville, Proctor, 2009]. Два гена E. faecalis , кодирующие АТФазу P-типа, EF1400 и белок SapB EF0759, значимо активируются в присутствии высоких концентраций цинка. Zn²⁺-чувствительный ДНК-связывающий мотив присутствует в промоторных областях этих генов [Abrantes, Kok, Lopes, 2014].

Кадмий. В настоящее время считается, что кадмий не является кофактором биохимических процессов в клетке и по своей природе токсичен, нарушая клеточные процессы и вызывая гибель клеток выше определенного порога. Хотя этот металл может естественным образом присутствовать в окружающей среде или в результате антропогенного загрязнения, его распределение в окружающей среде имеет тенденцию быть неоднородным, и обычно он встречается в больших количествах только в определенных экосистемах [Parsons, Lee, Kathariou, 2020]. Кадмий оказывает чрезвычайно токсичное действие на микроорганизмы при относительно низких дозах [Abou-Shanab , Berkum, Angle, 2007]. Кадмий может связываться с сульфгидрильными группами и, как следствие, – нарушать функцию белка [Jungmann et al., 1993] . Кроме того, кадмий является репрессором тиоредоксина, который обеспечивает восстанавливающую способность для многих биологических реакций [Li, Krumholz, 2007]. Помимо этого, кадмий влияет на пролиферацию, дифференцировку, апоптоз клеток и увеличивает активацию онкогенов для канцерогенеза [Schwartz, Reis, 2000]. Несмотря на все вышеперечисленное, штаммы E. faecalis проявляют высокую естественную устойчивость к кадмию [Paplace, Boutibonnes, Auffray, 1996]. В процессе защиты E. faecalis от кадмия участвуют такие гены, как cadA, ppx и dsbAм . Механизм абсорбции и устойчивости к кадмию начинается с системы поглощения магния, цинка и кальция [Wu et al., 2014]. Затем кадмий частично транспортируется через АТФазы P-типа [Tsai, Yoon, Lynn, 1992], осажденный фосфатными группами, которые секретировались PpX в виде фосфида кадмия. Затем белок DsbA связывается со свободным ионом кадмия в цитозоле для защиты тиоредоксина и других белков [Wu et al., 2014].

Несмотря на то, что тяжелые металлы могут естественным образом присутствовать в окружающей среде в результате антропогенного загрязнения, их распределение в окружающей среде бывает неоднородным, и они обычно встречаются в больших количествах только в определенных экосистемах. Тем не менее, детерминанты устойчивости к токсичным металлам широко распространены у грамположительных бактерий и содержатся либо в хромосомах, либо на мобильных генетических элементах, таких как транспозоны и плазмиды, включая интегративные и конъюгативные элементы. Эти детерминанты могут распространяться посредством горизонтального переноса генов и, таким образом, могут быть широко распространены и высококонсервативны [Parsons, Lee, Kathariou, 2020]. Деятельность человека, способствующая такому распространению, и является однозначным фактором, модифицирующим микробиоценоз морских и пресноводных экосистем, что требует включать мониторинг за чувствительностью энтерококков к тяжелым металлам в рутинные схемы микробиологического мониторинга хотя бы на периодической основе. Цель работы – изучить влияние тяжелых металлов , выделенных из водной среды, на микробиологические свойства штаммов рода Enterococcus .

Материалы и методы исследований

Для исследования чувствительности штаммов рода Enterococcus к тяжелым металлам изучено 18 образцов воды из устья р. Вторая Речка (43.160456, 131.905963), т.к. река находится в черте города и подвержена загрязнению тяжелыми металлами [Шулькин, Богданова, Киселев, 2007]. Выделено 30 штаммов бактерий рода Enterococcus, идентификация проводилась методом полимеразной цепной реакции. Штаммы идентифицировали с помощью ПЦР с использованием известных праймеров гена 16S рРНК5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’ 5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’. Размер 440 п.о. [Skowron et al., 2016]. Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (Москва, Россия).

Морфологию бактериальных клеток оценивали методом окраски по Граму. Исследование производилось с помощью микроскопа марки Primo Start, производитель Zeiss. Отмечали окраску мазка, а также размер, форму, способ расположения бактерий на предметном стекле [Прунтова, 2005].

Изучение устойчивости к металлам. Устойчивость к металлам изучали на среде для морских микроорганизмов (СММ) (г/л: CaCO 3 – 1.0; MgSO 4 – 1.0; пептон – 5.0; дрожжевой экстракт – 5.0; K 2 HPO 4 –

0.2; глюкоза – 0.2; агар – 15.0; дистиллированная вода – 1 000; рН 7.8–8.1) с добавлением в качестве селективной добавки соли металлов (CuSO 4 , ZnSO 4 , CdSO 4 ) в возрастающих концентрациях. Автоклавировали при 121°С в течение 15 мин. Суточную культуру бактерий с помощью микробиологической петли засевали на чашки Петри с питательной средой СММ. Посев проводился в трех повторениях. Культуру выращивали при комнатной температуре в течение 2–3 суток. Учет результатов проводился по наличию или отсутствию роста на чашках с металлами [Бузолева, 2011].

Статистическая обработка данных производилась в программе STATISTICA 10. Графики и таблицы формировались в программе Excel.

Результаты и их обсуждение

При исследовании чувствительности бактерий рода Enterococcus, выделенных в р. Вторая Речка, выявлено, что все выделеные штаммы резистентны к тяжелым металлам (CuSO 4 , ZnSO 4 и CdSO 4 ). Они росли при концентрациях, которые превышали предельно допустимые концентрации (ПДК) [Шулькин, Богданова, Киселев, 2007].

ПДК для меди в морской воде составляет 0.05 мг/л, а в пресной – 0.01 мг/г [Коршенко, 2020], однако 17% (5) штаммов рода Enterococcus, выделенные в бухте р. Вторая Речка, росли при 1 500 мг/л. (рис. 1). При концентрации 1 450 мг/л происходит резкое снижение роста у 57% (17) штаммов рода Enterococcus , поэтому данные штаммы можно считать чувствительными, а 43% (13) продолжают расти, оставаясь при этом устойчивыми.

Рис. 1. Влияние различных концентраций меди на культивирование бактерии рода Enterococcus [The effect of different copper concentrations on the cultivation of bacteria of the genus Enterococcus ]

Отмечено изменение культуральных свойств: с увеличением концентрации CuSO 4 до 1 400 мг/л стали появляться непрозрачные колонии оранжевого цвета и с металлическим блеском, а другие колонии, наоборот, стали прозрачными. Также отмечено изменение морфологии бактерий рода Enterococcus: при концентрации 800 мг/л бактериальные клетки располагались парами; при концентрации 1 400 мг/л – бактериальные клетки располагались парами и наблюдалось незначительное увеличение размера клеток; при 1 500 мг/л клетки располагались парами и короткими цепочками и стали более круглыми по сравнению с более низкими концентрациями (рис. 2). Медь может оказывать токсическое воздействие на бактериальные клетки, что связано с ее влиянием на стабильность белков. Медь может как увеличивать, так и уменьшать стабильность белков, особенно тех, которые участвуют в работе рибосом, синтезе белка и регулировании окислительно-восстановительных процессов в клетке [Wiebelhaus et al., 2021].

ПДК для цинка в морской среде составляет 0.05 мг/л, а для пресных вод – 0.01 мг/л [Коршенко, 2020]. Однако изученные штаммы росли и при более высоких концентрациях (рис. 3), демонстрируя при этом различия в морфологии культуры. Также нами было выявлено, что 60% штаммов (18) росли при концентрации 2 150 мг/л и были определены нами как устойчивые, а 40% (12) прекращали рост и являлись чувствительными. При концентрации цинка, равной 800 мг/л, бактериальные клетки располагались парами; при концентрации 1 800 мг/л бактериальные клетки располагались парами, короткими и длинными цепочками и наблюдались плеоморфные клетки (мелкие кокки и крупные палочки); при концентрации 2 100 мг/л бактериальные клетки располагались парами, короткими и длинными цепочками (рис. 4).

Согласно литературным источникам, цинк, подобно меди, способен оказывать токсическое воздействие на бактерии. Это объясняется его влиянием на стабильность белков, которые играют ключевую роль в жизнедеятельности бактериальных клеток. Цинк может влиять на работу рибосом, которые отвечают за синтез белка в бактериальной клетке. Это может привести к нарушению синтеза необходимых белков и, как следствие, к снижению жизнеспособности энтерококков. Цинк играет важную роль в регу- ляции окислительно-восстановительных процессов в бактериальной клетке. Нарушение этих процессов может привести к снижению жизнеспособности энтерококков. Цинк может как увеличивать, так и уменьшать стабильность белков в бактериальной клетке. Это может привести к нарушению работы белков, которые необходимы для жизнедеятельности энтерококков [Frei et al., 2023].

Рис. 2. Влияние различных концентраций меди на морфологию бактерий рода Enterococcus (микроскоп Primo Start, 100×).

Концентрация CuSO 4 : а – контроль (среда СММ без добавления солей металлов), б – 800 мг/л, в – 1 400 мг/л, г – 1 500 мг/л

[Effect of different copper concentrations on the morphology of bacteria of the genus Enterococcus (Primo Start microscope, 100×).

CuSO 4 concentration: a – control (SMM medium without the addition of metal salts), b – 800 mg/l, c – 1400 mg/l, d – 1500 mg/l)]

Концентр ация ZnSO4 (мг/л)

Рис. 3. Влияние различных концентраций цинка на культивирование бактерии рода Enterococcus [The effect of different zinc concentrations on the cultivation of bacteria of the genus Enterococcus ]

ПДК для кадмия в морской воде составляет 0.01 мг/л, а для пресных вод – 0.005 мг/л [Коршенко, 2020]. Однако изученные штаммы росли и при более высоких концентрациях (рис. 5): выявлено, что 37% (11) штаммов растут при концентрации 750 мг/л, следовательно, данные штаммы можно считать устойчивыми, а 63% (19) – чувствительными. При концентрации кадмия 250 мг/л наблюдалось расположение клеток короткими цепочками; при концентрации 500 мг/л наблюдались короткие цепочки и небольшое количество плеоморфных клеток (разных форм и размеров); при концентрации 750 мг/л – наблюдались короткие цепочки и плеоморфные клетки (разных форм и размеров) (рис. 6).

Рис. 4. Влияние различных концентраций цинка на морфологию бактерий рода Enterococcus (микроскоп Primo Start, 100×).

Концентрация ZnSO 4 : а – контроль (среда СММ без добавления солей металлов), б – 800 мг/л, в – 1 800 мг/л, г – 2 200 мг/л

[Effect of different concentrations of zinc on the morphology of bacteria of the genus Enterococcus (Primo Start microscope, 100×).

Concentration of ZnSO 4 : a – control (SMM medium without the addition of metal salts), b – 800 mg/l, c – 1800 mg/l, d – 2200 mg/l]]

Рис. 5. Влияние различных концентраций кадмия на культивирование бактерии рода Enterococcus

[The effect of different cadmium concentrations on the cultivation of bacteria of the genus Enterococcus ]

В соответствии с данными, представленными в научной литературе, кадмий, как и другие тяжелые металлы, может оказывать токсическое воздействие на клетки бактерии. Это связано с его способностью накапливаться в клетках и нарушать их метаболические процессы. Проникая в клетки энтерококков, кадмий способен нарушать целостность их мембран, что приводит к гибели бактерий. Этот процесс обусловлен тем, что кадмий оказывает влияние на работу рибосом, отвечающих за синтез белка в бактериальной клетке. В результате может произойти нарушение синтеза необходимых белков, что негативно сказывается на жизнеспособности энтерококков. Кроме того, кадмий может нарушать работу ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных процессах в бактериальной клетке. Накопление кадмия в клетках энтерококков приводит к нарушению метаболических процессов, что негативно сказывается на жизнеспособности бактерий [Li, Krumholz, 2007; Wu et al., 2014]. Однако стоит отметить, что конкретные механизмы воздействия меди, цинка и кадмия на энтерококки требуют дальнейшего изучения. Также необходимо учитывать, что устойчивость энтерококков к цинку может зависеть от многих факторов, таких как концентрация цинка, время воздействия и другие условия эксперимента.

Рис. 6. Влияние различных концентраций кадмия на морфологию бактерий рода Enterococcus (микроскоп Primo Start, 100×).

Концентрация CdSO 4 : а – контроль (среда СММ без добавления солей металлов), б – 250 мг/л, в – 500 мг/л, г – 750 мг/л

[Effect of different cadmium concentrations on the morphology of bacteria of the genus Enterococcus (Primo Start microscope, 100×).

Concentration of CdSO 4 : a – control (SMM medium without the addition of metal salts), b – 250 mg/l, c – 500 mg/l, d – 750 mg]

Проблема устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам приобретает глобальный характер. С одной стороны, бактерии становятся все более устойчивыми к существующим препаратам, а с другой – разработка новых антибиотиков замедляется. В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных методов борьбы с инфекциями. Тяжелые металлы, такие как медь, цинк, железо и марганец, играют важную роль в клеточных процессах бактерий. Около 30–40% известных белков содержат металлический кофактор, который критически важен для их структуры или функции [Frei et al., 2023]. Однако эти же металлы становятся токсичными в высоких концентрациях, и бактерии стараются ограничить их поглощение. Тяжелые металлы, будучи токсичными, могут влиять на рост, морфологию и биохимическую активность бактерий, что может привести к изменениям биомассы, а также разнообразия и структуры сообщества [Zhao et al., 2019]. Таким образом, для защиты микробной клетки бактерии регулируют концентрацию тяжелых металлов, используя различные защитные механизмы, ферментативное преобразование в менее токсичные формы, снижение поглощения тяжелых металлов, или другие варианты, которые позволяют бактериям сопротивляться или переносить стресс, вызванный тяжелыми металлами [Gupta et al., 2023].

Заключение

Выяснено, что штаммы бактерий рода Enterococcus способны расти при концентрациях, в тысячи раз превышающие ПДК тяжелых металлов в морской и пресной воде. При увеличении концентрации тяжелых металлов у бактерий рода Enterococcus изменяются морфологические характеристики, а превышение минимальной ингибирующей концентрации приводит к гибели бактерии. По степени действия изученных металлов их можно расположить в следующей последовательности: Cd> Cu> Zn, 800 мг/л, 1 550 мг/л и 2 200 мг/л соответственно. Особенно это важно в связи тем, что устойчивость к тяжелым металлам является селективным фактором для штаммов энтерококков и способствует появлению генетических линий микроорганизмов, выделенных из водных объектов окружающей среды, обладающих измененными свойствами, такими как устойчивость к антимикробным химиопрепаратам.