Влияние травяной добавки на основе крапивы двудомной (Urtica dioica L.) и звездчатки средней (Stellaria media L.) в кормлении японских перепелов на параметры генерации активных форм кислорода клетками их цельной крови

Введение. В настоящее время актуальной проблемой птицеводства остается поиск дешевых кормовых добавок на основе растительного сырья, обладающих функциональными свойствами, такими как повышение иммунорезистентности организма птиц. Известно, что дикорастущие растения (крапива двудомная, звездчатка средняя) являются источником витаминов (А, Е, С, группы В) и микроэлементов [1]. Использование в составе комбикорма муки из крапивы для бройлеров приводит к улучшению переваримости питательных веществ, стимуляции роста, развития и продуктивности птицы [2, 3]. Звездчатка средняя используется в медицине как лекарственное растение, так как в своем составе содержит сапонины, дубильные вещества, флавоноиды. Сложность применения дикорастущих растений с целью повышения иммунорезистентности организма обусловлена тем, что недостаточно научных данных об их влиянии на определенные звенья иммунной системы. В одном растении могут содержаться вещества, стимулирующие и угнетающие иммунные реакции.

Одним из механизмов, обеспечивающих неспецифическую резистентность организма, является способность лейкоцитарных клеток крови продуцировать активные формы кислорода (АФК), которая наиболее выражена в состоянии антигенной индукции [4]. Информативным методом мониторинга функционального состояния клеток крови птиц, участвующих в неспецифических защитных реакциях, и способом контроля при коррекции актиоксидантных систем организма является хемилюминесцентный анализ клеток цельной крови перепелов [5, 6].

Актуальность исследования определятся отсутствием в доступной научной литературе данных о влиянии кормовых травяных добавок на основе растений Urtica Dioica L. и Stellaria Media L. на параметры генерации АФК клетками периферической крови птиц.

Цель работы . Изучение влияния травяной добавки на основе растений Urtica Dioica L. (крапивы двудомной) и Stellaria Media L. ( звездчатки средней) в кормлении японских перепелов на параметры генерации активных форм кислорода клетками их цельной крови.

Задачи исследований: выявить изменения кислородного метаболизма клеток крови японских перепелов при использовании травяной кормовой добавки крапивы двудомной и звездчатки средней; оценить состояние системы неспецифической резистентности организма японских перепелов при добавлении в их корм травяной муки (крапива двудомная, звездчатка средняя).

Объекты и методы исследований . Эксперимент проведен в сентябре 2016 года в Федеральном исследовательском центре Красноярского научного центра СО РАН.

Объект изучения: перепела (Coturnix japonica) яйценоского направления породы

Схема опыта

Японская, поступившие из фермерского хозяйства пос. Березовка Красноярского края. Формировали три группы 17-суточных перепелят по 10 голов в каждой. Длительность эксперимента составляла 7 недель до достижения периода максимальной яйценоскости птицы. Перепелов содержали в одноярусных клетках на 20 голов согласно установленным нормам [7].

Первая контрольная группа употребляла основной рацион (ОР), представленный комбикормом для перепелов, сбалансированным по основным питательным, минеральным и биологически активным веществам.

Две опытных группы дополнительно к основному рациону с 14-суточного возраста получали в корм травяную муку из растений Urtica Dioica L. и звездчатки средней Stellaria Media L. Во второй опытной группе использовали компонентную травяную добавку, содержащую к массе основного рациона 2 % травяной муки Stellaria Media L. и 1 % травяной муки Urtica Dioica L (табл.). Включение в состав кормовых добавок на основе компонентной растительной муки является эффективной формой обогащения рациона птиц биологически активными веществами [3] и, возможно, оказывает синергический эффект в иммунорезистентности организма.

Группа	Особенности кормления
	I этап – кормление перепелов в возрастном периоде 17-70 дней
I – контроль	ОР (полноценный комбикорм)
II – опыт 1	ОР + 3 % (к массе ОР) травяной муки Urtica Dioica L.
III – опыт 2	ОР + 2 % (к массе ОР) травяной муки Stellaria Media L. + 1 % (к массе ОР) травяной муки Urtica Dioica L.
	II этап – определение параметров хемилюминисценции (I max, S, T max ) крови перепелов в возрасте 70 дней в группах I, II, III

Анализ функциональной активности клеток в цельной крови перепелов, контрольных и получавших кормовые добавки, выполнен на базе МНЦ исследований экстремальных состояний организма ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН». Исследовано 14 голов клинически здоровых птиц в трех группах в возрасте 70 дней. Материалом для исследований служила цельная гепаринизированная кровь, взятая у птицы из подкожной локтевой (крыловой) вены.

Функциональную активность клеток периферической крови перепелов, разведенной в 2 раза раствором Хенкса, при антигенной стимуляции in vitro оценивали по кинетике генерации АФК, регистрируемой микрометодом люминол-и люцигенинусиленной хемилюминесценции с использованием аппаратурно-программного комплекса «Хемилюминометр CL-3604» – ПЭВМ (СКТБ «Наука») [2, 8]. Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 90 минут при температуре в регистрационной камере +42оС. Реакционная смесь регистрационной кюветы состояла из 200 мкл 2,2х10-4 М люминола (Sigma) в растворе Хенкса (рН 7,2) или люцигенина ("Sigma-Aldrich", Switzerland) 10-4М на растворе Хенкса при рН=7,4, 100 мкл разведенной крови перепелов, 50 мкл суспензии монодисперсных частиц латекса (ВНИИСК, С-Петербург) (5х 108 част./мл), опсонизированных белками пуловой сыворотки крови кур. Хемилюминесцентные зонды люцигенин и люминол обладают выраженной селективностью в отношении первичных (О2-) и вторичных (ОH-, HClO-, H2O2, липопере-кисных) кислородных радикалов соответственно [4]. О кинетике генерации АФК в системе клеток цельной крови перепелов при антигенной активации in vitro (активированная) или без нее (спонтанная) судили по параметрам хемилюминесцентной кривой, принимая во внимание наиболее информативные: амплитуду максимальной интенсивности хемилюминесцентной реакции (Imax – имп./с), время достижения максимума (Tmax – мин) и площадь под кривой хемилюминесценции (S – имп. за 90 мин), определяющей общее количество АФК, генерируемых клетками за время записи хемилюминесцентной кривой, а также индекс активации (ИА=Sакт./Sспонт., усл. ед.) как отношение интегральных свето-сумм индуцированной и спонтанной ХЛ. Результаты исследований обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента [9]. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследований. Известно, что травяная мука из крапивы двудомной содержит витамины, каротиноиды и флавоноиды, обладающие антиоксидантным действием [1,3]. Мик-роэлементный состав (магний, железо, медь, калий, барий, кальций, кремний, марганец и др.) может способствовать проявлению проокси-дантных свойств. Поступление в организм пищи, обогащенной этими компонентами, оказывает корректирующее действие на функционирование про- и антиоксидантных систем организма, в том числе и крови [10, 11].

Анализ хемилюминесцентной кинетики генерации АФК выявил рост максимальной интенсивности продукции люцигенинзависимых АФК клетками крови японских перепелов при использовании в кормлении птиц травяной муки из растений крапивы двудомной ( Urtica Dioica L.) и звездчатки средней ( Stellaria Media L.) (рис. 1).

Рис. 1. Кинетика антигениндуцированной (а) и спонтанной (б) генерации люцигенинзависимых АФК клетками крови японских перепелов при обычном рационе кормления (1) и при добавлении в него муки из Urtica Dioica L. (2) или смеси из Urtica Dioica L. и Stellararia Media L. (3)

В сравнении с контролем в опыте 2 снизи- люминолзависимых АФК на 8,9 % и повысилась лась максимальная интенсивность продукции люцигенинзависимых АФК на 83,5 % (рис. 2).

люминол

200 E

* 150

X П5

E 100

IH

Контроль Опыт 1    Опыт2

□ актив.

□ спонт.

люминол

1,00E+06

s 8,00E+05

s 6,00E+05 re

E 4,00E+05

2,00E+05

0,00E+00

Рис. 2. Параметры хемилюминесцентной кинетики спонтанной и активированной in vitro генерации АФК клетками цельной крови японских перепелов

Показатели максимальной интенсивности спонтанной продукции АФК в опыте 1 ниже, чем в контроле: для люминолзависимых АФК – в 1,7 раза, для люцигенинзависимых АФК – в 2,1 раза. Суммарный объем генерации люминолза-висимых АФК увеличивается на 16,5 % в опыте 1 и на 6,92 % в опыте 2, а люцигенинзависимых АФК увеличивается в 1,3 раза в опыте 1 и в 2,3 раза в опыте 2. Время выхода на максимум ин- дуцированной продукции люминолзависимых АФК увеличилось незначительно в опыте 1 и в 1,6 раза в опыте 2, а люцигенинзависимых АФК увеличилось в опыте 1 на 31,3 % и опыте 2 – на 20,8 %. Полученные результаты указывают на повышение функциональной активности клеток цельной крови японских перепелов при использовании как кормовой травяной добавки на основе Urtica Dioica L., так и компонентной расти- тельной муки из Urtica Dioica L. и Stellararia Media L.

Индекс активации, который отражает потенциальные возможности клеток крови японских перепелов к генерации свободных форм кисло- рода в ответ на антигенную стимуляцию in vitro [12], люминолзависимых АФК повысился в 2,15 раза в опыте 1, в 1,22 раза – в опыте 2, люциге-нинзависимых АФК в опыте 1 повысился в 2,54 раза, в опыте 2 – в 1,54 раза (рис. 3).

Рис. 3. Влияние травяной добавки Urtica Dioica L.и Stellaria Media L. на индекс активации продукции АФК клетками цельной крови перепелов

Полученные данные свидетельствуют о повышении потенциальных возможностей клеток крови к генерации как первичных, так и вторичных АФК при использовании в кормлении японских перепелов в большей степени 3 % травяной муки на основе Urtica Dioica L.

Выводы

• 1.    Использование в кормлении японских перепелов травяной муки из крапивы двудомной ( Urtica Dioica L.) и звездчатки средней ( Stellaria Media L.) вызывает изменение кислородного метаболизма клеток крови: снижает объемы спонтанной продукции АФК и стимулирует объемы индуцированной in vitro продукции АФК, что указывает на повышение функциональной активности клеток крови.

• 2.    Травяные добавки на основе растений Urtica Dioica L. и Stellaria Media L . влияют на реактивность системы неспецифической резистентности организма японских перепелов, повышая потенциальные возможности клеток к генерации активных форм кислорода.