Влияние трития на морфо-анатомическую структуру растений вида тростник обыкновенный (Phragmites australis)

Одной из проблем бывшего Семипалатинского испытательного полигона (СИП) является загрязнение природных зон радионуклидом тритием. К такой зоне относится р. Шаган [1, 2]. Радионуклидное загрязнение вод р. Шаган обусловлено влиянием подземного термоядерного испытания с целью отработки технологии создания искусственных водоёмов, в результате которого образовался водоём «Атомное» озеро. Кроме того, загрязнение является и последствиями подземных ядерных испытаний в вертикальных скважинах на испытательной площадке «Бала-пан». Современное состояние водной среды р. Шаган характеризуется присутствием долгоживущих техногенных радионуклидов ³Н, ⁹⁰Sr, ^239+240Pu. Присутствие ⁹⁰Sr и ^239+240Pu фиксируется только в пределах выхода реки из загрязнённых грунтов «Атомного» озера на уровне 0,03 Бк/кг и 0,002 Бк/кг соответственно. Основное загрязнение компонентов экосистемы р. Шаган обусловлено повышенным содержанием радионуклида ³Н [3, 4]. На некоторых участках русла в поверхностных водах содержание 3 Н составляет 4-10 5 Бк/кг, что более чем в 50 раз превышает уровень вмешательства для питьевой воды. Содержание ³Н в свободной воде растений, произрастающих в её береговой зоне, достигает 2-10 5 Бк/кг. Значения удельной активности 3 Н в свободной воде растений и органически связанном веществе достигают n x 10²-n x 10⁵ Бк/кг [5, 6].

Особенностью последствий ядерных испытаний является формирование высоких дозовых нагрузок на биоту до уровней, способных привести к разрушению наиболее радиочувствитель-

Янкаускас А.Б. * – инженер; Ларионова Н.В. – учёный секретарь, к.б.н.; Шатров А.Н. – начальник лаборатории. Филиал ИРБЭ НЯЦ РК. *Контакты: 071100, Республика Казахстан, Восточно-Казахстанская обл., Курчатов, ул. Бейбит-Атом, 2. Тел.: 8(72251) 3-29-13;

ных экосистем. В настоящее время признано, что система нормирования радиационного воздействия на биоту должна быть ориентирована на защиту популяций. Поэтому исследования биологических эффектов в популяциях, населяющих территории, контрастные по уровню и спектру дозообразующих радионуклидов, играют уникальную роль в развитии и обосновании принципов экологического нормирования [7]. Растительные популяции, подвергающиеся хроническому облучению, могут характеризоваться, как ускоренным мутационным процессом, так и различными в зависимости от мощности дозы, уровнями активации систем адаптации к стрессовым факторам окружающей среды. Вместе с тем, именно ситуация хронического облучения представляет особый интерес с точки зрения установления пределов допустимого радиационного воздействия на компоненты экосистем [8, 9].

Интерес к 3Н с точки зрения его влияния на растительный организм вызван его способностью с высокой скоростью включаться в биологические процессы. Вместе с тем, инкорпорированный в органические соединения тритий представляет определённую опасность, так как он обладает очень низкой энергией радиоактивного излучения. Данный факт служит причиной больших поглощённых доз в местах включения этого радионуклида. В связи с чем, он может являться мощным мутагенным фактором. Тритий в составе молекул воды (тритированная вода) очень легко усваивается растениями, как через устьичный аппарат, так и в результате корневого поглощения. В дальнейшем 3Н инкорпорируется в органические структуры растения вследствие метаболических процессов, в частности фотосинтетических реакций [10-13]. Примерно 10-30% органической фракции, содержащей инкорпорированный 3Н, может варьировать при изменении концентрации радионуклида в окружающей среде [14]. Если никаких изменений концентраций 3Н в окружающей среде не происходит, то его содержание в растениях находится на неизменном уровне. Включение 3Н в состав органического вещества может привести к накоплению данного радионуклида в органах и тканях растений [15].

До настоящего времени, вопрос о влиянии ³Н на морфо-анатомическую структуру растений тростника ( Phragmites australis ) на территории СИП не изучен. Таким образом, цель нашей работы – выявить наличие изменений в морфо-анатомической структуре растений, произрастающих в условиях тритиевого загрязнения.

Материалы и методы

В рамках исследования морфо-анатомических параметров растений, произрастающих на участках радионуклидного загрязнения СИП, в качестве территории обследования выбран район р. Шаган. Исследовательские площадки закладывали вдоль по руслу, всего заложено 10 исследовательских площадок (рис.1). Каждая площадка представляла собой участок площадью примерно 1 м². Расстояние между площадками составило от 100 до 1000 м. По результатам измерения мощности эквивалентной дозы (МЭД) и плотности потока β-частиц можно отнести данные участки к фоновым, основные значения МЭД равны 0,09-0,10 мкЗв/ч, плотность потока β-частиц <10 част/мин⋅см². В качестве опытного растения выбран тростник обыкновенный ( Phragmites australis ).

В условиях эксперимента в естественных условиях оказать влияние на ход исследования могут абсолютно любые факторы, как биотические, так и абиотические. Таким образом, помимо определения радионуклидного состава, одной из задач стало определение элементного состава воды и растений. Аналогичным образом в местах отбора проб растений произведён отбор проб воды для проведения химического анализа и определения степени минерализации. Для морфологических исследований отобраны надземные части растения, проведены измерения основных параметров, таких как высота растения, длина метёлки, длина листа. Для исследования анатомических параметров с каждого растения отбирали фрагменты стеблей и листьев. В полевых условиях образцы органов растений фиксировали с использованием копенгагенской смеси, которую готовили путём смешивания: этиловый спирт 96% – 13 мл, глицерин – 0,5 мл, дистиллированная вода – 5 мл. Данная смесь подходит для фиксации материала, если в дальнейшем его не предполагается обезвоживать и пропитывать парафином.

Рис. 1. Расположение точек отбора проб.

Из фиксированных образцов получали препараты для исследования. Из препаратов готовили срезы с использованием микротома. Толщина среза образца зависела от состояния растения и жёсткости волокон. В среднем для стебля толщина срезов составила 25-30 мкм, для листьев – 30 мкм. Полученный препарат исследовали при помощи тринокулярного микроскопа Microscope Rose MC 300 (Austria) с цифровой камерой Vision Cam V500/21 (Austria). При помощи камеры и программного обеспечения BioWizard 4.2 делали снимки и измерения параметров исследуемых образцов. В качестве исследуемых параметров стебля выбраны: диаметр стебля, толщина эпидермы, толщина склеренхимы, площадь проводящих пучков, расположенных в паренхиме. В качестве исследуемых параметров листа выбраны: толщина верхнего эпидермиса, толщина нижнего эпидермиса, диаметр пузыревидных клеток эпидермы, толщина мезофилла, площадь проводящего пучка 1-го порядка, площадь проводящего пучка 2-го порядка.

Содержание 3Н в растениях определялось в свободной воде, полученной в результате конденсации транспирируемой жидкости растениями внутри специальных герметичных установок с водосборниками. Все образцы подготовлены для проведения бета-спектрометрического анализа по определению 3Н в свободной воде растений и органической составляющей с использованием автоматической установки для сжигания и подготовки проб для определения органически связанного трития Sample Oxidyzer (USA). Измерение 3Н проводилось при помощи жидкосцинтилляционного спектрометра Quantulus 1220 (USA).

Определение металлов в воде проводилось согласно методике ИСО 17294-2 «Качество воды – применение масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. Часть 2: Определение

62 элементов». Определение содержания металлов проводилось методом ИСП-МС и ИСП-АЭС, с использованием квадрупольного масс-спектрометра Elan 9000 фирмы «Perkin Elmer SCIEX» (USA) в комплекте с компьютером и специализированным программным обеспечением.

За период исследования произведено порядка 8000 измерений анатомических параметров стебля и листа. Первым шагом в статистической обработке данных была проверка распределения морфо-анатомических параметров на нормальность, которую осуществляли с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения эмпирического распределения с теоретическим используется критерий λ , который рассчитывается согласно выражению:

■^ эмпир = ^,                                                                (1)

где D – наибольшее значение абсолютной разности между накопленными частотами эмпирического и теоретического распределений; n – объём выборки.

Теоретическое значение λ не зависит от объёма выборки и числа степеней свободы, а определяется только уровнем значимости. Для уровня значимости 0,05 значение λ=1,36. Если Аэмпир < -^0,05, то нет оснований считать, что эмпирические и теоретические частоты отличаются существенно. Таким образом, в данной работе выполнено сравнение теоретических частот нормального распределения с частотами эмпирического распределения [16]. Как следует из расчётов, в подавляющем большинстве случаев значение Яэмпир < Ятеорет, что говорит о том, что эмпирические распределения морфо-анатомических параметров от нормального распределения отличаются несущественно. Исключением являются параметры склеренхимы и площади проводящего пучка в пробах площадки 4. Здесь величина Яэмпир существенно превышает значение Ятеорет. В данных случаях делается предположение о логарифмически нормальном распределении. Для проверки данной гипотезы от значений параметров склеренхимы и площади проводящего пучка были взяты натуральные логарифмы. Полученные значения были вновь проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Расчёты показали, что значения натуральных логарифмов склеренхимы и площади проводящего пучка в пробе площадки 4 распределены по нормальному закону. Тогда исходные значения данных параметров распределены по логарифмически нормальному закону. На рис. 2 демонстрируются типичные распределения морфо-анатомических параметров по частоте встречаемости (эмпирические и теоретические).

Рис. 2. Типичные эмпирические и теоретические распределения анатомических параметров по частоте встречаемости.

Как показано на графиках (рис. 2), практическое распределение значений стебля соответствует теоретическому распределению. Таким образом, мы можем утверждать, что полученные данные достоверны и могут быть использованы для дальнейших аналитических расчётов.

Аналогичным образом получены значения Я _эмпир для всех морфо-анатомических параметров листа для каждой площадки. Как и в предыдущем случае, установлено, что в подавляющем большинстве значение Я _эмпир < Я _теорет . Исключением являются параметры мезофилла и площади проводящего пучка 2-го порядка в образцах площадки 2 и 10. Здесь величина Я _эмпир превышает значение Я _теорет . В данных случаях делается предположение о логарифмически нормальном распределении.

Результаты и обсуждение

С целью подтверждения идентичности условий произрастания все образцы растений и воды прошли элементный анализ (табл. 1).

Таблица 1 Элементный состав воды в точках отбора

№	Общая минерализация воды, мкг/г	Содержание элементов в воде, мкг/л
		Li	Al	Mn	Co	Ni	Cu	Mo	Pb	U
1	7500	29±2	10±0,1	176±0,4	1,4±0,05	6,5±0,1	11±0,4	21±1	0,8±0,04	16±0,1
2	6600	36±3	6,0±0,3	46±1	1,7±0,03	6,4±0,5	7,0±0,4	14±1	0,14±0,04	17±0,4
3	6800	51±4	4,2±0,3	85±1	1,8±0,04	7,0±0,2	9,1±0,3	22±0,4	0,2±0,05	27±0,4
4	7700	34±3	5,6±0,1	42±1	1,2±0,02	4,5±0,2	8,4±0,1	14±1	0,1±0,01	18±0,1
5	6700	41±1	7,0±0,3	34±1	1,0±0,03	3,5±0,4	4,6±0,1	17±1	0,6±0,02	25±0,5
6	6700	28±1	6,7±0,6	43±0,2	0,8±0,06	0,7±0,1	3,0±0,1	12±0,4	0,4±0,06	16±0,1
7	4200	22±2	8,5±0,1	123±1	1,0±0,05	4,4±0,5	10±0,1	13±0,3	0,1±0,04	12±0,1
8	6600	26±2	9,1±0,2	14,0±0,1	1,0±0,03	3,4±0,4	7,9±0,1	14±0,3	0,1±0,03	13±0,2
9	5600	59±1	4,1±0,1	150±1	3,2±0,02	10±0,2	10±0,2	13±1	0,2±0,02	31±0,1
10	7300	70±6	12,0±0,4	180±2	1,8±0,1	8,9±0,4	9,5±0,1	27±1	9,0±0,2	41±0,2

Полученные значения элементного анализа воды для каждой исследовательской площадки соответствуют нормальным значения для водоёма данного типа и общей минерализацией в 5600-7700 мкг/г. Уран, зафиксированный в пробах воды, имеет природное происхождение и обусловлен геохимическими особенностями данного региона. Значения концентрации элементов в образцах воды находятся приблизительно в одном диапазоне значений. Из чего следует, что при обнаружении потенциальных отклонений в растениях влияние элементного состава воды можно исключить. Для полной картины образцы растений прошли проверку на химический состав (табл. 2).

Таблица 2

Содержание элементов в образцах растений

	Элементный состав
	Al	Mn	Fe	Co	Ni	Cu	Zn	Cd	Pb	U
Содержание элементов в растениях, мг/кг	9-30	170-470	66-100	0,05-0,13	0,9-2,9	1,3-19	4,2-16	<п.о. 0,01	0,11 – 7,0	0,01-0,08
Диапазон нормальных значений	до 200	20-400	50-100	0,02-1	0,1-5	5-23	до 45	0,05-0,2	до 8	0,005-0,08

При анализе полученных данных элементного анализа проб воды и растений и для выявления наиболее важных элементов-загрязнителей использован метод сравнения полученных результатов со встречающимися типичными концентрациями элементов в растениях по данным исследователей [17, 18]. Содержание элементов в растениях для всех исследовательских площадок идентично. Значения концентраций элементов в растениях на исследовательских площадках не превышают значений опубликованных данных. Из чего следует, что идентичность условий произрастания опытных образцов установлена, и можно исключить влияние такого фактора, как загрязнение воды и растений металлами.

Радионуклидный анализ. На основе лабораторных анализов получены значения удельной активности радионуклида ³Н в свободной воде растений и в органической составляющей (табл. 3).

Содержание 3Н в свободной воде растений и в органическом веществе

Таблица 3

№	Удельная активность 3Н в свободной воде, Бк/кг (M±m)	Удельная активность 3Н в органической составляющей, Бк/кг (M±m)
1	580 ± 60	230 ± 30
2	900 ± 90	390 ± 50
3	6,5 х 104 ± 0,7 х 104	2,4 х 104 ± 0,2 х 104
4	2,9 х 104 ± 0,3 х 104	5,4 х 103 ± 0,5 х 103
5	1,3 х 104 ± 0,1 х 104	4,2 х 103 ± 0,4 х 103
6	8,0 х 103 ± 0,8 х 103	2,7 х 103 ± 0,3 х 103
7	1,0 х 103 ± 0,1 х 103	400 ± 50
8	1,2 х 103 ± 0,1 х 103	390 ± 50
9	850 ± 90	410 ± 50
10	5,9 х 103 ± 0,6 х 103	2,0 х 103 ± 0,2 х 103

По результатам проведённых исследований установлено, что удельная активность ³Н в свободной воде растений достигает значений 6,5 х 10⁴±0,7 х 10⁴ Бк/кг, в органической составляющей - 2,4 х 10⁴±0,2 х 10 4 Бк/кг.

Морфо-анатомические параметры. Вид Phragmites australis - многолетнее травянистое растение. На основе лабораторных и аналитических работ произведен расчёт средних арифметических значений морфологических параметров с ошибкой репрезентативности (M±m). Высота растений колеблется в диапазоне 110±15 - 150±25 см (норма 100-400 см), длина листа 22±4 -30±4 см (норма 5-30 см), метелки 15±4 - 19±9 см (норма до 50 см). Значения морфологических параметров соответствуют нормальным встречающимся значениям для тростника Phramites australis [19].

Стебель полый, трубчатый, волокна жёсткие, диаметр стебля варьирует от 1,7±0,1 до 3,4±0,1 мм. Покровная ткань, представленная эпидермой, состоит из одного слоя клеток, толщина которых варьирует от 8,4±0,2 до 11,0±0,6 мкм. Клетки овальной, слегка продолговатой формы. На поперечном срезе видно, что стебель пронизан тяжами проводящих пучков, состоящих из сосудов ксилемы, погруженных в паренхиму (рис. 3). Площадь проводящего пучка стебля варьирует в пределах от 14,2±1,0 до 40,0±1,0 мкм2.

Сосуды ксилемы в проводящих пучках стебля Phragmites australis расположены беспорядочно, обеспечивая транспорт воды и минеральных веществ от корня по стеблям к остальным органам и тканям растения, а также выполняя функцию арматуры, что особенно важно для травянистых растений, и растений, лишённых древесного прочного стебля, как в случае с тростником. Толщина склеренхимы варьирует от 97±2,2 до 170±4,7 мкм.

Рис. 3. Поперечный срез стебля Phragmites australis (х 20).

Листовые пластинки линейно-ланцетного типа. Толщина листа в поперечном срезе достигает 160±27 - 220±29 мкм (рис. 4). Покровная ткань листа представлена однослойным эпидермисом, форма клеток прямоугольная. В зависимости от стороны листа размеры клеток адаксиального и абаксиального эпидермиса различаются. Толщина адаксиального (верхнего) эпидермиса варьирует от 10,6±0,3 до 12,6±0,4 мкм, толщина абаксиального (нижнего) эпидермиса варьирует от 12,1 ±0,3 до 15,2±0,6 мкм. Произрастая в достаточно засушливых климатических условиях, эпидерма листьев выработала защитные приспособления: в наиболее засушливое время листья имеют свойство сворачиваться в трубочку за счёт расположения на адаксиальной стороне пузыревидных (водоносных) клеток эпидермиса, расположенных в виде продольных тяжей. Таким образом, пузыревидные (моторные) клетки способствуют сжиманию и разжиманию листовой пластинки, снижая возможность испарения. Диаметры пузыревидных (водоносных) клеток эпидермиса достигают значений от 75,0±2,4 до 110,5±2,1 мкм.

Рис. 4. Поперечный срез листа Phragmites australis (х20) .

Между двумя слоями эпидермы располагается слой мезофилла (хлоренхима), толщина которого варьирует от 120±5,1 до 200±7,3 мкм. Клетки неправильной округлой формы либо слегка вытянуты, однородны, размеры различны. Имеются включения в виде хлоропластов, погружённых в цитоплазму клеток мезофилла. Проводящая ткань листа представлена пучками 1-го и 2-го порядков, различающихся хорошо развитыми сосудами ксилемы, осуществляющими перенос воды от корней в листья. Площадь проводящего пучка 1-го порядка варьирует от 13000±1200 до 27000±1600 мкм2, площадь проводящего пучка 2-го порядка варьирует от 4200±300 до 13500±600 мкм2.

Зависимость анатомических параметров стебля от содержания ³Н в растениях. Изменения анатомических показателей стебля и листа от содержания ³Н в свободной воде и в органическом веществе рассмотрены графическим способом. При изучении эмпирических рядов, нанесённых на график, установлено, что количественные изменения параметров диаметра стебля и толщины склеренхимы происходят линейно и выражаются уравнением параболы первого порядка, т.е. прямой y=a-bx . При рассмотрении эмпирических рядов регрессии для толщины эпидермы и площади проводящего пучка, сделано предположение, что в данном случае имеются закономерности параболической ниспадающей, выражаемой уравнением параболы второго порядка, вида y=a+bx+cx² . В результате расчётов установлено, что содержание ³Н в органически связанном веществе растений изменяется прямо пропорционально содержанию ³Н в свободной воде, и коэффициент корреляции между этими переменными соответствует значению 0,97. Таким образом, в качестве примера на графиках рис. 5 представлен характер изменений анатомических параметров стебля от изменений удельной активности ³Н в свободной воде растений.

Рис. 5. Зависимость анатомических параметров стебля от содержания 3Н в свободной воде растений.

При исследовании влияния содержания трития на толщину склеренхимы и диаметра стебля установлено, что при увеличении удельной активности 3 Н в диапазоне nx 10 2 -10 5 Бк/кг наблюдается значимое уменьшение анатомических параметров. При изучении влияния содержания ³Н на толщину эпидермы и площади проводящего пучка при построении эмпирических рядов регрессии была обнаружена иная тенденция: при увеличении удельной активности трития до значений nx10 3 -10 4 Бк/кг, величина толщины эпидермы возрастает, а затем происходит незначительное уменьшение параметров, значения площади проводящего пучка уменьшаются.

В целом, установлена тенденция к изменениям анатомических параметров стебля от изменения содержания в них трития. Данный факт подтверждают значимые значения коэффициентов регрессии и детерминации. Предполагается, что значение коэффициента детерминации превышает 0,5. В этом случае коэффициент множественной корреляции превышает 70%. Такие модели можно признать достоверными и указывающими на функциональную зависимость между переменными.

Изменения анатомических показателей листа от содержания 3Н в свободной воде и в органическом веществе также рассмотрено графическим способом. При изучении эмпирических рядов, нанесённых на график (рис. 6), установлено, что количественные изменения параметров верхнего и нижнего эпидермиса происходят линейно и выражаются уравнением параболы первого порядка, т.е. прямой y=a+bx. При рассмотрении эмпирических рядов регрессии для осталь- ных изучаемых параметров, сделано предположение, что в данном случае имеются закономер- ности параболической ниспадающей, выражаемой уравнением параболы второго порядка, вида y=a+bx+cx2.

Удельная активность 3Н в свободной воде растений, Бк/кг

=88000-41500 х+5100 х

Удельная активность 3Н в свободной воде растений, Бк/кг

Рис. 6. Зависимость анатомических параметров листьев от содержания ³Н в свободной воде растений.

105       10*       10s

Удельная активность5 Н в свободной воде растений, Бк/кг

Удельная активность *Н свободной воде растений, Бк/кг

При изучении анатомических параметров листа установлено, что толщина верхнего и нижнего эпидермиса с увеличением удельной активности 3Н в свободной воде не изменяется. Коэффициент регрессии (R=-0,2 – -0,3) подтверждает отсутствие статистической связи между объясняемой переменной (толщиной эпидермиса) и факторами (удельной активностью 3Н).

При построении эмпирических рядов регрессии для остальных изучаемых параметров, а именно диаметра пузыревидных клеток, толщины мезофилла, площади проводящих пучков листа 1-го и 2-го порядков, сделано предположение, что здесь имеет место закономерность параболической ниспадающей, выражаемой уравнением параболы второго порядка, вида y=a+bx+cx² . При увеличении удельной активности 3 Н до значений nx10 4 Бк/кг значения анатомических параметров листа уменьшаются, достигая минимальных значений. При дальнейшем увеличении удельной активности 3 Н до значений nx10 5 Бк/кг наблюдается общая тенденция к незначительному увеличению анатомических параметров. Коэффициент детерминации (R²=0,7 – 0,85) подтверждает наличие статистической связи между объясняемой переменной (диаметр пузыревидных клеток, толщина мезофилла, площадь проводящего пучка 1-го и 2-го порядков) и аргументом (удельной активностью ³Н в свободной воде растений).

Заключение

В результате проведённых исследований установлено наличие влияния радионуклида ³Н на анатомическую структуру растения тростник (Phragmites australis) . Произведена статистическая обработка данных. Получено типичное для всех площадок распределение значений анатомических параметров стебля и листа. В ходе исследований установлено, что при увеличении удельной активности 3 Н в свободной воде растений до значений nx10 3 -nx10 5 наблюдается уменьшение таких анатомических параметров стебля, как диаметр, толщина склеренхимы, площадь проводящего пучка; происходит изменение анатомических параметров листа таких, как толщина мезофилла, диаметр пузыревидных клеток, площадь проводящего пучка 1-го и 2-го порядков. Поскольку в данном эксперименте мы имеем дело, по большому счёту, с внутренним облучением от радионуклида ³Н, мы можем предполагать, что изменения на анатомическом уровне обусловлены специфичностью радионуклида ³Н, который, являясь изотопом водорода, имеет аналогичные свойства и ведёт себя подобно стабильному элементу: способен встраиваться в клеточные стенки растений.