Влияние углеводной корректировки сырья на рост молочнокислых микро организмов в процессе направленного ферментирования овощей

2020;(6):99-103.

Materials and methods. The purpose of this research work was to ensure the direction of the biotechnological process in the direction of stabilization of the concentration of functional microflora (starting systems of lactic acid microorganisms), under the influence of introduced carbohydrate nutrients. In this work, we studied two fermentation systems of microorganisms that are fundamental microorganisms in the fermentation of cabbage, namely, systems consisting of a pre-fermenta-tion culture of Leuconostoc mesenteroides and one of the cultures of lactobacilli: Lactobacillus plantarum or Lactobacillus brevis. The study used the usual microbiological method for determining the number of microorganisms by seeding in an agarized culture medium, as well as processing experimental data.

Received: 23.07.2020

Accepted for publication: 06.11.2020

Accepted: 20.12.2020

Results. As a result, we found that the introduction of a carbohydrate Supplement allows us to stabilize the dynamics of changes in the concentration of the studied starting systems at the same initial level throughout the main stage of fermentation.

П роцесс урбанизации современного общества характеризуется не только позитивными, но и рядом негативных изменений в области экологии, структуры и качества питания. В данной ситуации интересно внимание к ферментированным продуктам. Пищевая ценность ферментированных продуктов уже давно признана. Такие продукты используются практически во всем мире. С помощью ферментации увеличивается срок годности продуктов. Ферментированные продукты – это продукты, наделенные еще и определенными функциональными свойствами [1,2,3].

В качестве ферментационных субстратов могут выступать как сырье животного, так и растительного происхождения.

Интерес к технологии ферментирования обусловлен следующими аспектами: благодаря применению различных технологий ферментированные продукты могут иметь разнообразный вкус и структурные свойства [3]. Также нельзя не отметить, что качество производимого ферментированного продукта является очень важным. Но важно подчеркнуть, что особенно это актуально в случае порой нестандартных растительных субстратов, поэтому, чем стабильнее необходим конечный продукт, тем более наукоемкой должна быть технология ферментации.

Нельзя не отметить глубокое укоренение микробиологических знаний в области производства молочных продуктов [4] и большую научную и практическую школу.

Исследования и наработки в области управления процессами ферментации овощного сырья, конечно, тоже имеются. Так еще в 50-х годах прошлого столетия было доказано, что применение чистых культур при квашении овощей не только ускоряет кислотообразование, но придает молочнокислому брожению большую направленность и способствует повышению качества квашеных овощей. Однако уже в те годы задумались о недостатках технологии, которая совмещала процессы брожения и хранения, требующие различных условий для их проведения [5].

Существует биотехнологическое изобретение на использование заквасочного микроорганизма Lасtоbасillus brеvis для квашения капусты, датируемое 1991 годом [6]. Есть в России работа по применению стартовых молочных культур L. plantarum для квашения капусты [7]. Согласно литературным данным описаны инновационные методы квашения капусты с применением чистых культур. В литературе описаны коммерческие культуры-закваски, которые состоят из бактерий, образующих молочную кислоту и ароматические вещества (то есть условно делятся на 2 категории – кислотообразующую и ароматобразующую), к бактериям, используемым при производстве сквашенных растительных продуктов, относятся Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bul-garicus, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc dextranicum, выбор и состав используемых комбинаций определяется желаемыми свойствами и условиями ферментации [8]. Также известны работы по ведению процессов молочнокислого брожения овощей, в частности, квашения капусты с использованием чистых культур Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, L.acidophilus [9], а также работы по применению промышленной закваски «Наринэ» для квашения капусты [10]. Хотя согласно авторам [7] у нас в стране в большинстве случаев при изготовлении квашеной капусты используют традиционный метод, при котором капуста сквашивается только за счет эпифитной микрофлоры сырья.

Если речь идет о получении стандартизированного сброженного продукта типа квашеной капусты, то процесс управления ферментацией (брожением) овощей – сложный вопрос. Сложность, во-первых, заключается в том, что исследования по изучению направленной ферментации овощей сталкиваются с рядом непростых особенностей: в первую очередь ферментация овощей – это процесс преемственный, т.е. сначала участвуют одни микроорганизмы, затем эстафетную палочку подхватывают другие виды микроорганизмов; во вторую очередь - сырье в случае производства квашеной капусты не пастеризуется. В случае применения заквасок - проблема в установлении преемственности микроорганизмов – это очень большая трудность [2].

Во-вторых, сложностью является и тот факт, что в ассоциациях заквасочных штаммов необходимо учитывать, что между ними могут быть симбиотические (стимуляция развития культур при их совместном культивировании), антагонистические (подавление развития одной из культур при их совместном культивировании) и метабиотические взаимоотношения [11].

В-третьих, сложность, как и в любом биотехнологическом процессе, заключается в множественности параметров. Так, например, если рассмотреть параметры, оказывающие влияние только лишь на рост микроорганизмов, являющихся неотъемлемой частью биотехнологической ферментации, то мы увидим большой спектр параметров, а именно рН, содержание влаги, окислительно-восстановительный потенциал, содержание питательных веществ, антимикробные компоненты, температура, присутствие и концентрация газов, присутствие и активность других микроорганизмов и др. [12].

В комплексной программе развития биотехнологий (технологий с использованием микроорганизмов для получения необходимых человеку веществ / продуктов), в Российской Федерации на период до 2020 года говорится о важности для экономики и о необходимости массового внедрения биотехнологий и биотехнологических продуктов при модернизации технологической базы современного промышленного производства [13].

Во ВНИИТеК – филиале ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН проводятся обширные работы по изучению биотехнологических основ микробной трансформации растительного сырья на примере ферментации белокочанной капусты.

Основное нарушение течения биотехнологического процесса состоит в подавлении жизнедеятельности функциональной микрофлоры на жизненном цикле ее развития, которое вызывается нехваткой питательных веществ и наличием контаминирующей популяции [14].

Таким образом, базовым аспектом безопасной ферментации является сохранение функциональной микрофлоры на активном этапе и недопущение развития микроорганизмов порчи и т.п.

Для обеспечения этого аспекта необходимо достаточное количество сахаров (глюкозы и фруктозы) в исходном сырье, 4% и выше, что гарантирует накопление достаточного количества молочной кислоты и других органических кислот, что позволяет исключить развитие нежелательной микрофлоры (гнилостных и маслянокислых микроорганизмов) [15]. Как известно, кочаны капусты белокочанной содержат 7-8% сухого вещества, 4-6% сахаров, в среднем 30 мг/100 г аскорбиновой кислоты, основная часть сахаров – это моносахара: 3,23% (от 1,28 до 5,69%), на фруктозу приходится примерно 0,7%, на глюкозу – 1% [16].

Очевидно, что сахаров, присутствующих в капусте, достаточно для проведения классической ферментации.

Известно, в классическом периодическом культивировании, т.е. культивировании, в котором единожды вносится питательная среда и культура, меняется темп роста микроорганизмов, кривые роста культуры проходят классические фазы: лаг-фаза, фаза экспоненциального роста, фаза замедленного роста, стационарная фаза и фаза отмирания. Известно, что в таких различных стадиях развития культуры одновременно со скоростью изменяется и физиологическая активность микроорганизмов. Быстрорастущие клетки потребляют вещества и образуют продукты обмена гораздо быстрее, чем клетки, рост которых начал замедляться. Первые обладают меньшей устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам [8]. При непрерывном культивировании, в котором используются непрерывно обновляемые питательные среды, можно задержать культуру на любой стадии развития [17,18,19].

Цель исследования: изучение влияния углеводной корректировки сырья на развитие молочнокислых микроорганизмов в процессе направленной ферментации капусты белокочанной сорта Парус.

Материалы и методы

Для проведения эксперимента были выбраны:

стерильная модифицированная модельная среда на основе белокочанной капусты сорта Парус (исходное сырье предоставлено ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства»);

две стартовые (заквасочные) системы: L. mesenteroides / L. plantarum и L. mesenteroides / L. brevis.

Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum являются одними из основных молочнокислых бактерий при производстве квашеной капусты, также известно, что L. brevis является микроорганизмом, принимающим активное участие при естественном квашении капусты [3,1].

L. mesenteroides и L. brevis являются гетерофермента-тивными микроорганизмами, L. plantarum является гомо-ферментативным микроорганизмом [12].

Были использованы следующие штаммы микроорганизмов: штамм Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides 37Y, Lactobacillus brevis штамм В-1309, Lactobacillus plantarum штамм 578/26.

Штамм Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides 37Y, номер в коллекции ВКПМ: В-8818, культурально-мор- фологические признаки: клетки – овальные кокки, колонии – мелкие белого цвета, округлой формы [20]. Штамм предоставлен Всероссийской Коллекцией Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика.

Lactobacillus brevis штамм В-1309 , культурально-морфологические особенности штамма: мелкие палочки с закругленными концами, размером 0,7-1,0х2,0-4,0 мкм, грампо-ложительные, неспорообразующие, гетерофакультативный анаэроб, сбраживает лактозу, глюкозу, фруктозу и другие сахара [21]. Штамм предоставлен Всероссийским научноисследовательским институтом пищевой биотехнологии – филиалом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи.

Lactobacillus plantarum штамм 578/26 (родословная: штамм получен из Lactobacillus plantarum ВКМ В-578 ), культурально-морфологические особенности штамма: неподвижные палочки размером 0,9-1,2х3-8 мкм, грамположи-тельные неспорообразующие аэротолерантные, сбраживают фруктозу, глюкозу, лактозу и другие сахара, обладает способностью к синтезу бактериоцинов [22]. Штамм предоставлен Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевой биотехнологии – филиалом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи.

Подготовку культур проводили следующим образом: культуры, находящиеся на хранении, пересевали в жидкую питательную среду MRS, термостатировали при температуре 30°С в течение 72 часов, определяли начальный титр суспензии микроорганизмов.

Приготовление модельной среды осуществляли следующим образом: в измельченную простерилизованную массу белокочанной капусты сорта «Парус» вносили NaCl из расчета 1,5% и аскорбиновую кислоту из расчета 0,035%.

Инокуляцию модельной среды для проведения предварительной стадии ферментации проводили культурой Leuconostoc mesenteroides в количестве 1,75±0,05%. Полученную массу перемешивали, помещали в специальную емкость с возможностью откачивания воздуха, откачивали воздух и ставили в термостат на +24°С на трое суток.

Затем в случае опыта без углеводной добавки в предварительно проферментированную массу вносили инокулят в двух вариантах: Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum. Инокулят вносили в количестве 1,75±0,05% от массы капусты.

Для проведения опыта с углеводной добавкой был произведен расчет внесения этой углеводной добавки в массу, выполненный в предыдущих исследованиях. В предварительно проферментированную массу вносили 0,23% глюкозы и 0,9% фруктозы. Тщательно перемешивали. Далее вносили инокулят в двух вариантах в количестве 1,75±0,05%.

Отбирали на анализ, остальную массу расфасовывали по микроцентрифужным пробиркам типа «Эппендорф» и убирали обратно в термостат на +24°С. По прошествии семи суток после начала предварительной стадии, пробирки перемещали в холодильник для хранения при температуре 4±2°С.

Отбор проб проводили на 0, 1, 4, 5, 7, 18, 29 сутки после начала основной стадии ферментирования.

Исследования проводили путем посева в агаризованную питательную среду МРС разведений отобранного образца, инкубирования посевов при температуре 30°С в течение 120 часов, подсчета всех видимых колоний и расчета количества микроорганизмов, присутствующих в 1 г пробы (концентрации). Подсчет количества микроорганизмов и доверительных интервалов производился по ГОСТ ISO 72182015 [23].

Результаты

На рисунке 1 представлены данные по изменению концентрации молочнокислых микроорганизмов в модельной среде на основе капусты белокочанной сорта Парус без углеводной корректировки.

Рис.1. Зависимость концентрации L plantarum, L. brevis и их консорциума от продолжительности основного этапа ферментации

Fig. 1. The dependence of the concentration of L plantarum, L. brevis and consortium on the duration of the main fermentation stage

Анализ результатов экспериментальных данных и моделирования показал, что условия модельной среды, модифицированной на этапе предварительной ферментации, являются относительно неблагоприятными для развития микроорганизмов рода L. brevis , количество которых снижается с 8-го порядка до 0 за 28 суток ферментации. В то же время концентрация L plantarum снижается всего на 3 порядка за это же время.

Следует отметить, что динамика снижения количества молочнокислых микроорганизмов в консорциуме не так выражена, как у монокультур и снижение концентрации микроорганизмов за аналогичный период ферментации чуть больше одного порядка. Таким образом, мы видим явное преимущество использования молочнокислых микроорганизмов в качестве стартерных культур не в виде

Рис.2. Зависимость концентрации L. plantarum, L. brevis и их консорциума от продолжительности основного этапа ферментации после углеводной корректировки

Fig.2. The dependence of the concentration of L plantarum, L. brevis and consortium on the duration of the main fermentation stage after carbohydrate adjustment монокультур, а в виде консорциума этих микроорганизмов.

На рисунке 2 представлены данные по изменению концентрации молочнокислых микроорганизмов в модельной среде на основе белокочанной капусты сорта «Парус» с углеводной корректировкой среды. Углеводная корректировка была рассчитана на основании ранее проведенных исследований и составила 219 мг глюкозы на 100 г среды и 842 мг фруктозы соответственно.

После дополнительного внесения глюкозы и фруктозы в исследуемую среду, количество L. brevis снижается всего на 0,5 порядка за все время ферментации. У L. plantarum в первое время наблюдается значительный рост концентрации (практически на 2 порядка), который происходит в первые 7 сут ферментации, затем идет незначительное снижение, которое по прошествии 30 сут ферментации не достигает даже стартовой концентрации. В консорциуме наблюдается также незначительное снижение титра (с 8 до примерно 7 степени).

Заключение

Внесение углеводной добавки позволяет перевести ход ферментации с участием двух стартерных систем из хаотичного падения количества целевой микрофлоры в четко отрегулированный, направленный процесс. Данный прием привел к стабилизации процесса, как по значению уровня концентрации, так и по поддержанию этого уровня на протяжении всего периода основной стадии ферментации.

Об авторах:

Жанна Александровна Семенова – научный сотрудник

Jeanne A. Semenova – Researcher

Nataliya E. Posokina – Cand. Sci. (Engineering), Head of the laboratory,

Vladimir I. Tereshonok – Cand. Sci. (Agriculture),

Senior Researcher