Влияние условий культивирования на содержание альфа-фазы в бактериальной целлюлозе

Химически модифицированные нанофибриллы бактериальной целлюлозы могут найти широкое применение в нанотехнологии, например, в качестве микроскопических электродов [3]. Природная целлюлоза I имеет две полиморфные модификации – α- и β-формы целлюлозы [1]. Считается, что Iα-целлюлоза метастабильна и, соответственно, обладает более высокой реакционной способностью по сравнению с Iβ-формой целлюлозы. Вследствие этого Iα-целлюлоза будет являться участком первичной реакции, и соответственно, преобладание α формы в целлюлозе позволило бы проводить химическую модификацию целлюлозы в более мягких условиях. Показано, что наивысший процент Iα-фазы (∼70%) имеет бактериальная целлюлоза. Yamomoto и Horii [5] обнаружили, что доля целлюлозы Iα варьируется от 64% в целлюлозе валония и бактериальной целлюлозе до 20% в рами и хлопковой. Условия культивирования продуцента бактериальной целлюлозы могут значительно изменить уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы. В связи с этим представляет интерес определение влияния условий культивирования на содержание Iα-формы целлюлозы в бактериальной целлюлозе.

В качестве продуцента бактериальной целлюлозы использовали бактерии Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ – 11267. Для культивирования штамма продуцента использовали HS (Hestrin–Schramm) среду [4]. Бактериальную целлюлозу получали при культивировании продуцента в стационарных условиях при комнатной температуре в течение 7 суток. Гель-пленку бактериальной целлюлозы очищали последовательной обработкой 0,5%-ным раствором NaOH и 0,2 н соляной кислоты при температуре 80 °С в течении 60 минут. После каждого этапа обработки гель-пленку длительно отмывали от щелочи и кислоты.

Определение Iα-фазы бактериальной целлюлозы проводили с помощью инфракрасной спектроскопии. Расчет содержания Iα-фазы бактериальной целлюлозы проводили с помощью уравнений 1-3 [6].

X 1α = A α /(A α +A β ) (1)

A α = A 750 см^-1 – A 800см^-1 (2)

A β = A 710 см^-1 – A 800см^-1 (3) где: A 750 см^-1 – поглощение в инфракрасном спектре при 750 см ^-1 ;

A 710 см^-1 – поглощение в инфракрасном спектре при 710 см ^-1 ;

A 800 см^-1 – поглощение в инфракрасном спектре при 800 см ^-1 .

На уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы оказывают влияние такие параметры как количество используемого источника углерода, дополнительно вносимые в питательную среду вещества, режим культивирования и уровень аэрации. В связи с этим была проведена оценка влияния этих параметров не только на уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы, но и на содержание Iα-фазы в бактериальной целлюлозе.

В качестве источника углерода использовали глюкозу. Содержание глюкозы в питательной среде составляло 5; 6,5; 10 и 20 г/л. Уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы при увеличении концентрации источника углерода возрастал линейно и составлял 0,73 0,82 1,07 и 1,42 г. сухой бактериальной целлюлозы на литр питательной среды соответственно. Однако перерасчет на 1 г используемой сахарозы приводил к обратной линейной зависимости. Степень превращения глюкозы в целлюлозу был максимален при более низкой концентрации глюкозы и составлял 14,6%. При стандартном содержании глюкозы (20 г глюкозы на 1 л. среды) степень превращения глюкозы в целлюлозу составила 7,1%, что в 2 раза меньше, чем при концентрации глюкозы в среде 5 г/л.

Результаты анализа содержания Iα-фазы в бактериальной целлюлозе, полученной при выращивании продуцента на питательных средах с разным содержанием глюкозы с помощью инфракрасной спектроскопии, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание глюкозы в среде, г/л	Содержание α – фазы в бактериальной целлюлозе, %
5	34 ±3
6,5	38 ±2
10	36 ±3
20	35 ±2

Влияние содержания источника углерода на содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе

Из представленной таблицы следует, что содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе не изменялось при изменении количества сахарозы в питательной среде.

Известно, что этиловый спирт увеличивает уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы. Предполагается, что это связано со снижением уровня образования мутантов, не способных к синтезу бактериальной целлюлозы. Содержание этилового спирта в среде варьировали от 0,5 до 2%. При выращивании продуцента в условиях отсутствия этилового спирта уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы составляет 0,73 г/л по истечению 7 суток статического культивирования. Добавление этилового спирта к питательной среде в количестве 2% приводило к увеличению уровня биосинтеза бактериальной целлюлозы до 2,17 г/л. Использование этилового спирта в количестве 0,5 и 1% приводило к увеличению уровня биосинтеза целлюлозы до 1,71 и 2 г/л соответственно. Результаты анализа содержания Iα-фазы в бактериальной целлюлозе, полученной при выращивании продуцента при различных концентрациях спирта с помощью инфракрасной спектроскопии, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе в зависимости от концентрации этилового спирта в питательной среде

Концентрация этилового спирта, %	Содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе, %
0	40±3
0,5	39±2
1	37±2
1,5	37±3
2	38±2

Из данной таблицы следует, что содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе не меняется при добавлении этилового спирта в концентрации от 0,5 до 2%. В связи с этим можно сделать вывод, что несмотря на то, что этиловый спирт приводит к значительному увеличению уровня биосинтеза бактериальной целлюлозы, тем не менее, он не влияет на содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе.

При использовании в качестве источника углерода глюкозы происходит образование глюконовой кислоты, которая является побочным продуктом, снижающим pH и, как результат, уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы. Известно, что образование глюконовой кислоты снижается, а производство бактериальной целлюлозы увеличивается при добавлении в среду лигносульфонатов. Это объясняется наличием антиоксидантов и полифенольных соединений в лигносульфонатах. Как следует из таблицы 3, добавление лигносульфоната в питательную среду не приводит к изменению содержания α-фазы в бактериальной целлюлозе.

Таблица 3

Изменение содержания α-фазы в бактериальной целлюлозе в зависимости от концентрации лигносульфоната в питательной среде

Концентрации лигносульфоната, %	Содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе, %
0,5	37±2
1	35±2
1,5	36±2

В статических условиях культивирования уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы несколько выше чем в динамических условиях выращивания продуцента бактериальной целлюлозы. Результаты анализа содержания Iα-фазы в бактериальной целлюлозе, полученной при культивировании в стационарных и динамических условиях с помощью инфракрасной спектроскопии, представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние статических и динамических условий культивирования на содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе

Условия культивирования	Содержание α – фазы в бактериальной целлюлозе, %
Статические условия	37±2
Динамические условия	36±2

Из данной таблицы следует, что содержание α-формы целлюлозы в бактериальной целлюлозе не меняется при использовании статических или динамических условий культивирования продуцента этого полисахарида.

На уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы большое влияние оказывает уровень аэрации. В связи с этим было рассмотрено влияние уровня аэрации при глубинном выращивании продуцента бактериальной целлюлозы на изменение содержание α-формы целлюлозы в синтезируемой бактериальной целлюлозе (см. табл. 5).

Таблица 5

Зависимость содержания a-фазы бактериальной целлюлозы от интенсивности аэрации при динамических условиях культивирования

Условия аэрации	Содержание α-фазы в бактериальной целлюлозе, %
0,9 м 3 /мин 300 об/мин	31±1
1,5 м 3 /мин 300 об/мин	33±2
2 м 3 / мин 300 об/ мин	29±1

Из приведенной таблицы можно сделать заключение, что изменение условий аэрации не приводит к какому либо значительному снижению содержания α-фазы в бактериальной целлюлозе.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что исследуемые условия культивирования продуцента бактериальной целлюлозы, влияющие на уровень биосинтеза бактериальной целлюлозы, практически не влияют на содержание альфа-фазы в бактериальной целлюлозе.