Влияние васкулярного эндотелиального фактора роста на сперматогенез после облучения электронами дозой 2 гр

Введение. Одной из наиболее частых причин снижения фертильности у мужчин, затрагивающего около 7 % населения, является ионизирующее излучение, используемое для лечения злокачественных опухолей яичек [1]. Некоторые авторы сообщают о том, что под действием облучения наблюдается снижение количества сперматозоидов, изменение их морфологии и подвижности, что связано с нарушением репликации ДНК и транскрипции РНК [2].

Регуляция сперматогенеза на всех стадиях осуществляется одним из паракринных факторов местного действия – васкулярным эндотелиальным фактором роста (VEGF), который продуцируется в т.ч. тромбоцитами [3]. VEGF способствует пролиферации и дифференцировке сперматогоний, влияет на микросреду яичка и, следовательно, на формирование сперматозоидов [4].

В последнее время васкулярный эндотелиальный фактор роста используют в различ-

ных областях медицины, в т.ч. и для коррекции сниженной фертильности у мужчин, но его влияние на сперматогенез остается малоизученным.

Цель исследования. Оценка влияния васкулярного эндотелиального фактора роста на сперматогенез после облучения электронами дозой 2 Гр.

Материалы и методы. Исследование проводили на базах Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба и Сеченовского Университета. Использовали самцов половозрелых крыс линии Wistar. Все манипуляции выполняли согласно Международным рекомендациям по проведению медикобиологических исследований с использованием животных (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Экспериментальные животные (n=135) были поделены на 5 групп: I – контрольные крысы (n=10), которым внутрибрюшинно вво-

дили физиологический раствор (0,9 % раствор NaCl, 33,6 мл/кг); II (n=35), III (n=30), IV (n=30) группы – однократное локальное облучение семенников электронами (доза 2 Гр, мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ, частота 9 Гц, диаметр поля 100 мм, использован линейный акселератор NOVAC-11). Кроме того, в III группе крысам вводили плазму, обогащенную тромбоцитами, с низким содержанием лейкоцитов (LP-PRP) и рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); в IV и V группах – LP-PRP. Длительность эксперимента – 84 сут – выбрана в соответствии с продолжительностью двух циклов сперматогенеза крыс. Животных всех групп выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика. Извлеченные семенники взвешивали, фиксировали в растворе Буэна, заливали в парафиновые блоки, срезы толщиной 3–4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и готовили для иммуногистохимического исследования.

Микроскопический анализ выполняли с помощью системы видеомикроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG), морфометрические данные получали с использованием программного обеспечения для обработки и

анализа изображений Leica Application Suite, Version 4.9.0.

Для иммуногистохимического исследования в качестве первичных использовали кроличьи поликлональные антитела к VEGF-A (Millipore; клон ABS82; 1:50), вторичных – универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, Cell Marque, США). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет клеток (в %) проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ×400.

Полученные в результате подсчета данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0,01.

Результаты и обсуждение. В семенниках контрольной группы отмечали умеренную положительную цитоплазматичекую ИГХ-реак-цию с антителами к VEGF во всех половых клетках на разных стадиях сперматогенеза (22,1 ± 3,4 %), особенно в сперматогониях, а также в клетках Сертоли и Лейдига (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Table 1

Доля VEGF-позитивных клеток в семенниках групп животных, %

The proportion of VEGF-positive cells in testes of the experimental and control animals, %

Группа Group	Половые клетки Germ cells	Клетки Сертоли Sertoli cells	Клетки Лейдига Leydig cells
Контроль Control	89,2 ± 1,1	84,1 ± 2,1	76,2 ± 2,4
2IR 84-е сут 2IR 84th day	12,2 ± 1,1	83,2 ± 1,3	74,1 ± 1,5
2IR+LP-PRP+IGF-1 84-е сут 2IR+LP-PRP+IGF-1 84th day	76,4 ± 2,3	84,1 ± 1,1	76,6 ± 2,1
2IR+LP-PRP 84-е сут 2IR+LP-PRP 84th day	71,1 ± 1,3	83,3 ± 1,5	75,2 ± 1,3
LP-PRP 84-е сут LP-PRP 84th day	88,2 ± 1,0	83,7 ± 0,7	75,7 ± 1,3

Контрольная группа Control group

II группа Group II (2IR)

III группа Group III (2IR+LP-PRO+IGP-1)

IV группа                      V группа

Group IV (2IR+LP-PRP)

V group (LP-PRP)

Рис. 1. Семенные канальцы крыс после локального облучения электронами дозой 2 Гр. Иммуногистохимические реакции с антителами к VEGF-A, докрашивание гематоксилином, ×400

Fig. 1. Seminiferous tubules of rats after local electron irradiation (2 Gy).

Immunohistochemical reactions with antibodies to VEGF-A, stained with hematoxylin, magnification ×400

Через 2 нед. после локального облучения у животных II, III, IV групп обнаружили нарушение гистоархитектоники семенников, проявляющееся гипосперматогенезом. Данные патоморфологические изменения сохранялись во II группе весь период эксперимента.

После облучения наблюдали снижение числа ИГХ-позитивных половых клеток в 2,0 раза (10,2 ± 1,2 %) по сравнению с группой контроля.

У животных III и IV групп на фоне введения LP-PRP, содержащей в т.ч. васкулярный эндотелиальный фактор роста, обнаружили постепенное увеличение VEGF-окрашенных половых клеток в 2,0 раза (18,2 ± 1,2 %) и 1,5 раза (16,1 ± 1,1 %) соответственно, в первую очередь пула сперматогенных стволовых клеток, сперматогоний, что, вероятно, связано с действием VEGF. При этом в III группе репаративные процессы произошли с опереже-

нием на 3–4 нед. за счет того, что животным дополнительно вводили рекомбинантный IGF-1.

В V группе, не подвергавшейся облучению, после введения LP-PRP значительных изменений по сравнению с контролем не выявлено.

Члены семейства VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E) являются лигандами трансмембранных рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3 [5], которые экспрессируются в т.ч. в сперматогони-альных стволовых клетках. Реализация положительных эффектов происходит при связывании VEGF с его рецептором после аутофосфорилирования и последующей активации PI3K/AKT- и Ras/MAPK-путей [6, 7, 9, 10]. В результате активации данных путей наблюдаются неоваскулогенез и увеличение площади кровеносных сосудов в семенниках, что улучшает трофику и проницаемость гематоте-

стикулярного барьера для транспорта биологически активных веществ [8], тем самым стимулируя пролиферацию и дифференцировку половых клеток, способствуя восстановлению сперматогенеза и спермиогенеза, усиливая эффекты других факторов роста [9].

Заключение. Облучение электронами дозой 2 Гр в семенниках приводит к уменьшению VEGF-позитивных клеток, а введение PRP, содержащей в т.ч. васкулярный эндотелиальный фактор роста, усиливает репаративные процессы, восстанавливая сперматогенез.