Влияние внешнего облучения и криоконсервации на качество спермы быков-производителей

Организация воспроизводства стада является одной из ключевых проблем животноводства в условиях радиоактивного загрязнения территории.

Результаты экспериментальных исследований показали высокую чувствительность системы воспроизводства к действию ионизирующей радиации. Было установлено, что любые виды излучения приводят к дегенеративным изменениям в семенниках и нарушению сперматогенеза у самцов. Так, реакция семенников лабораторных животных свидетельствует о значительных нарушениях сперматогенеза вплоть до стерильности [1]. В то же время, количество работ, посвящённых оценке действия радиации на воспроизводительные качества самцов сельскохозяйственных животных, невелико [2, 3].

Практически не изучена возможность криоконсервации (замораживания) спермы от быков, подвергшихся воздействию внешнего гамма-излучения. Вместе с тем промышленное животноводство и племенная работа основаны именно на методе криоконсервации спермы быков-производителей. Возможность криоконсервации спермы позволяет хранить её несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния, всегда иметь на станциях сперму лучших производителей, значительно увеличить количество осеменённых маток и сократить поголовье производителей. Глубокая заморозка спермы является стрессом для сперматозоидов. После размораживания определённая часть клеток погибает и при работе со спермой здоровых животных. Поэтому изучение воздействия двух факторов: внешнего облучения и последующего замораживания спермы от облучённых быков представляет большой научный и практический интерес.

Асташева Н.П.* - проф., д.б.н., Финансово-технологическая академия; Лазарев Н.М. - зав. лаб., к.б.н., УкрНИИСХР НУБиП.

Цель работы: изучить сочетанное действие внешнего облучения и последующей криоконсервации на основные показатели спермопродукции быков-производителей.

Материалы и методы

В эксперименте на 16 племенных быках-производителях чёрно-пёстрой породы было изучено влияние внешнего облучения на физиологическое состояние животных, их воспроизводительные качества, а также влияние криоконсервации на качество спермы от облучённых быков.

По принципу аналогов были сформированы пять групп: контроль - 4 головы и по 3 головы в группах, подвергавшихся внешнему облучению в дозах 1, 2, 3 и 4 Гр. Облучение животных проводили на установке «Гамма-панорама», источник излучения 137Cs, мощность дозы 1 Гр/час.

Рацион кормления животных был сбалансирован по основным питательным веществам. Водопой с помощью автопоилок без ограничения. Животные постоянно пользовались активным моционом.

Оценку клинико-физиологического состояния быков-производителей осуществляли по следующим показателям: поведение при кормлении и отборе спермы, температура тела, пульс, дыхание. Гематологические исследования проводили до облучения и на 3, 7, 15, 30, 45 и 60 сутки после радиационного воздействия, далее ежемесячно в течение года. Изучали: количество лейкоцитов, эритроцитов и концентрацию гемоглобина по общепринятым методикам.

Оценку воспроизводительных качеств облучённых производителей проводили по комплексу показателей, характеризующих спермопродукцию.

Сперму для исследований получали у быков-производителей по схеме, принятой в племенных хозяйствах, - один раз в неделю методом дуплетных садок с помощью механического станка и вагины. Свежеполученную сперму быков оценивали в лаборатории в течение 30 мин. после получения по следующим показателям: масса спермы, подвижность, концентрация, активность дыхательных ферментов и количество мёртвых спермиев [4]. После определения качественных показателей свежеполученной спермы быков эякулят разбавляли лактозо-глицерино-желточным разбавителем и замораживали в виде гранул на фторопластовых пластинах по общепринятой технологии [5]. Хранили сперму в жидком азоте. Замораживание спермы определённым образом влияет на качество спермы, полученной даже от здоровых животных. Поэтому качество спермы обязательно проверяют после размораживания перед осеменением коров по показателям подвижность и выживаемость при температуре 38 °С.

Размораживание спермы для проверки её качества осуществляли в электрической термобане с регулируемой температурой. Замороженную сперму быков после оттаивания исследовали по ГОСТ 27777-88 [4]. Оценивали выживаемость спермиев, подвижность и коли-титр. Подвижность спермиев для быков мясных пород допускается не ниже 3 баллов.

Результаты исследований

Изучение клинико-физиологического состояния быков-производителей, подвергшихся воздействию внешнего гамма-излучения, выявило типичную картину острой лучевой болезни различной степени тяжести. Так, облучение животных в дозах 1-2 Гр вызывало лучевую болезнь лёгкой степени, без значительных изменений в поведении животных и их клиническом состоянии. Облучение быков в дозах 3-4 Гр вызывало лучевую болезнь средней степени тяжести, у отдельных животных наблюдали признаки тяжёлой степени лучевого поражения с чётко выраженной симптоматикой. Гибель одного быка, облучённого в дозе 4 Гр, наступила на 27 сутки после облучения.

У быков, облучённых в дозах 3-4 Гр, наблюдали снижение потребления корма, повышенную жажду, разжижение каловых масс, появление в них примеси крови. Животные были ослаблены, адинамичны, наблюдался тремор мышц, учащённое дыхание, точечные кровоизлияния на слизистых оболочках.

Глубина изменений гематологических показателей зависела от дозы облучения. Так, на 7 сутки после облучения концентрация лейкоцитов у быков, облучённых в дозе 1 и 2 Гр, снизилась на 28% по сравнению с исходным уровнем, а в группах, облучённых в дозах 3 и 4 Гр, – на 44 и 55% (табл. 1). Максимальное снижение количества лейкоцитов в крови быков-производителей было зафиксировано на 15 сутки после облучения и составило: при облучении в дозе 1 Гр - 37% (5,0-109/л); при дозе 2 Гр - 39% (4,5-109/л); 3 Гр - 60% (3,0-109/л) и при облучении в дозе 4 Гр - 58% (2,8- 109/л).

Таблица 1

Динамика изменения количества лейкоцитов в крови быков (х109/л)

Сутки	Доза, Гр
	0	1	2	3	4
0	6,7 ± 0,6	7,9 ± 0,9	7,4 ± 0,8	7,5 ± 0,5	6,6 ± 0,5
3	6,8 ± 0,5	6,4 ± 0,3	6,6 ± 0,4	4,9 ± 1,3*	3,1 ± 0,3*
7	6,9 ± 0,6	5,7 ± 0,3	5,3 ± 0,8	4,2 ± 0,4*	3,0 ± 0,2*
15	6,9 ± 0,5	5,0 ± 0,8*	4,5 ± 1,0*	3,0 ± 0,5*	2,8 ± 0,9*
30	6,7 ± 0,5	7,1 ± 0,6	7,0 ± 0,7	3,6 ± 0,1*	2,0 ± 0,2*
45	6,7 ± 0,5	7,1 ± 0,6	6,9 ± 0,6	4,6 ± 0,2*	4,2 ± 0,2*
60	7,5 ± 0,1	6,7 ± 0,1	7,4 ± 0,1	4,0 ± 0,4	4,0 ± 0,2*
90	6,5 ± 0,5	6,1 ± 0,5	6,7 ± 0,1	6,3 ± 0,5	7,1 ± 0,1
200	6,3 ± 0,2	6,3 ± 0,3	7,2 ± 0,4	7,0 ± 0,5	7,7 ± 0,2
346	6,6 ± 0,1	6,1 ± 0,1	6,2 ± 0,1	6,5 ± 0,5	6,0 ± 0,5

* Р < 0,05.

У животных, облучённых в дозах 1 и 2 Гр, к 30 суткам концентрация лейкоцитов практически достигла исходного уровня и не отличалась от контроля; у быков, облучённых в дозе 3 Гр, в эти сроки начиналось восстановление количества лейкоцитов. В то же время у быков, облучённых в дозе 4 Гр, количество лейкоцитов продолжало снижаться и достигло на 30 сутки минимальных значений - 2,0-10 9 /л. Восстановление концентрации лейкоцитов до уровня контроля у животных, облучённых в дозах 3-4 Гр, произошло через три месяца после облучения.

Снижение концентрации эритроцитов наблюдали лишь у животных, облучённых в дозе 4 Гр, на 15-45 сутки после облучения - до 4,4-4,7-1012/л. Достоверное снижение концентрации гемоглобина в крови облучённых быков было зафиксировано также на 15-45 сутки при облучении в дозах 3-4 Гр.

Воспроизводительные качества быков-производителей оценивали в течение года после облучения. В разгар лучевой болезни на 10-20 сутки после облучения наблюдали снижение половой активности у быков, облучённых в дозах 3-4 Гр, они неохотно шли в станок, получение спермы затягивалось, требовалась дополнительная стимуляция половых рефлексов. Нормализация половых рефлексов у облучённых быков наступила лишь через 3-4 месяца после облучения. Объём эякулята у облучённых животных на 4 неделе после облучения снизился вдвое во всех облучённых группах. В дальнейшем отмечали периодические изменения объёма эякулята.

Одним из основных показателей качества спермопродукции быков-производителей является концентрация спермы. Следует отметить чёткую зависимость снижения концентрации спермы от дозы облучения и времени после облучения. Начало снижения концентрации спермы наблюдали через 4 недели после облучения. Максимальное снижение концентрации спермы было зафиксировано на 8-12 неделе после облучения (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменения концентрации спермиев (х1015/л)

Недели	Доза, Гр
	0	1	2	3	4
0	1,2 ± 0,1	1,2 ± 0,1	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,2	1,1 ± 0,2
2	1,3 ± 0,3	0,9 ± 0,1	1,3 ± 0,1	0,9 ± 0,3	1,0 ± 0,3
4	1,2 ± 0,2	1,0 ± 0,1	0,9 ± 0,1	1,0 ± 0,1	0,9 ± 0,1
6	1,3 ± 0,3	0,9 ± 0,3	1,0 ± 0,2	0,7 ± 0,1	0,9 ± 0,2
8	1,2 ± 0,2	0,6 ± 0,1	0,6 ± 0,1	0,5 ± 0,2	0,3 ± 0,05
12	1,3 ± 0,2	0,8 ± 0,2	0,4 ± 0,2	0,4 ± 0,05	0,3 ± 0,1
16	1,2 ± 0,08	0,7 ± 0,3	0,9 ± 0,1	0,5 ± 0,2	1,0 ± 0,1
20	1,2 ± 0,07	1,0 ± 0,2	1,3 ± 0,06	0,8 ± 0,1	0,8 ± 0,1
24	1,3 ± 0,1	1,0 ± 0,2	0,8 ± 0,2	0,7 ± 0,1	0,7 ± 0,1
28	1,2 ± 0,05	0,6 ± 0,1	1,0 ± 0,2	1,0 ± 0,1	0,7 ± 0,1
34	1,2 ± 0,2	1,2 ± 0,2	1,4 ± 0,3	1,2 ± 0,2	1,0 ± 0,2
40	1,1 ± 0,1	0,8 ± 0,1	1,1 ± 0,2	1,1 ± 0,1	0,9 ± 0,1
49	1,1 ± 0,1	1,2 ± 0,3	1,4 ± 0,1	0,9 ± 0,1	0,9 ± 0,1

Так, облучение быков в дозе 1 Гр вызывало снижение концентрации спермы через 8 недель после облучения на 40%, в дозе 2 Гр – на 54%, в дозе 3 Гр – на 58% и в дозе 4 Гр – на 75% по сравнению с исходным уровнем.

Восстановление концентрации спермы до исходного уровня наступало у животных, облучённых в дозе 1-2 Гр, на 20 неделе после облучения, в дозе 3 Гр – на 28 неделе и при облучении в дозе 4 Гр – на 32-34 неделе после облучения. У животных, облучённых в дозе 3-4 Гр, в течение года отмечали волнообразные изменения концентрации спермы, периодическое снижение показателя до (0,6-0,8)х1015/л.

Снижение подвижности спермиев у быков, облучённых в дозах 3-4 Гр, также зафиксировано через 4 недели после облучения, а при облучении в дозах 1-2 Гр – в более отдалённые сроки 10-12 недель.

У животных, облучённых в дозах 1-2 Гр, на 20-24 неделю (3-4 месяца) после облучения подвижность спермиев восстановилась до исходного уровня. В то же время у быков, облучённых в дозе 3-4 Гр, восстановление подвижности спермы наблюдали лишь на 44-46 неделе после облучения, практически через 11 месяцев.

Аналогичная временная зависимость наблюдается в динамике изменения активности дыхательных ферментов спермы. Достоверное снижение активности дыхательных ферментов спермы быков, облучённых в дозе 1 Гр, наблюдали в период с 4 по 22 неделю; в дозе 2 Гр – с 4 по 24 неделю, в дозе 3 Гр – с 2 по 42 неделю и в дозе 4 Гр – с 2 по 46 неделю после облучения.

Уже на второй неделе после облучения наблюдали значительное увеличение процента мёртвых спермиев у животных, облучённых в дозе 3-4 Гр, до 30-46%, при норме 16-18% (табл. 3).

Таблица 3

Недели	Доза облучения, Гр
	0	1	2	3	4
0	12,0 ± 0,5	9,3 ± 0,3	14,6 ± 1,4	11,6 ± 0,1	11,6 ± 0,1
2	13,0 ± 0,5	21,0 ± 0,5	17,3 ± 0,6	30,0 ± 0,5	46,6 ± 0,5
4	13,7 ± 0,6	30,0 ± 0,6	33,3 ± 0,3	36,6 ± 0,4	40,0 ± 0,7
6	14,0 ± 0,5	33,0 ± 0,3	33,3 ± 0,3	42,0 ± 0,6	45,0 ± 0,8
8	16,2 ± 0,1	36,6 ± 0,7	39,3 ± 0,5	65,0 ± 0,5	75,0 ± 0,7
12	7,5 ± 0,5	27,6 ± 0,9	45,0 ± 0,5	50,0 ± 0,5	57,5 ± 0,5
16	9,5 ± 0,5	35,0 ± 0,5	39,5 ± 0,5	42,5 ± 0,4	42,5 ± 0,4
20	15,7 ± 0,1	20,0 ± 0,5	33,3 ± 0,3	45,0 ± 0,5	50,0 ± 0,6
24	15,0 ± 0,3	40,0 ± 0,6	33,3 ± 0,2	30,0 ± 0,2	35,0 ± 0,3
28	15,0 ± 0,4	18,0 ± 0,6	25,5 ± 0,8	30,0 ± 0,5	35,0 ± 0,3
32	15,0 ± 0,5	20,1 ± 1,8	25,5 ± 0,3	30,0 ± 0,4	31,0 ± 0,3
40	15,0 ± 0,5	15,0 ± 1,5	20,0 ± 0,2	20,0 ± 0,2	35,0 ± 0,4
52	10,0 ± 1,5	10,0 ± 1,5	15,0 ± 0,2	15,0 ± 0,1	15,0 ± 0,2

Количество мёртвых спермиев (%)

Максимальное количество мёртвых спермиев было отмечено на 8 неделе после облучения. Увеличение количества мёртвых спермиев составило в группе, облучённой в дозе 1 Гр, – 36,6%; 2 Гр – 39,3%; 3 Гр – 65% и при дозе 4 Гр – 75%.

Снижение процента мёртвых спермиев до нормы наблюдали у животных, облучённых в дозе 1 Гр, через 28 недель после облучения, у облучённых в дозе 2 Гр – через 36 недель (7-8 месяцев).

У быков, облучённых в дозе 3 и 4 Гр, процент мёртвых спермиев снизился с максимальных значений до 25-30% на 28-30 неделю и на этом уровне регистрировался с периодическими увеличениями вплоть до 50 недель после облучения. То есть, практически на протяжении года после облучения процент мёртвых спермиев у облучённых быков был выше физиологической нормы.

Оценка качества спермы облучённых быков после криоконсервации выявила значительные нарушения подвижности и выживаемости спермиев. Так, подвижность спермиев от быков, облучённых в дозе 4 Гр, после криоконсервации уже на 4 неделе снизилась до 2,6±0,3 балла, при норме – 4,0 балла. С 8 по 20 неделю подвижность спермиев снизилась до 0. Восстановление подвижности криоконсервированной спермы зафиксировано лишь на 28 неделе (7 месяцев после облучения) при облучении в дозе 1-2 Гр и на 38-40 неделе при облучении в дозе 3-4 Гр. В то время как у контрольных животных подвижность спермиев после криоконсервации стабильно составляла 4,0 балла (табл. 4).

Таблица 4

Подвижность спермиев после криоконсервации (балл)

Недели	Доза облучения быков, Гр
	0	1	2	3	4
0	4	4	4	4	4
4	4	4	4	4	2,6 ± 0,3
8	4	0	0	0	0
12	4	1,3 ± 0,1	1,2 ± 0,1	0	0
16	4	0	0	0	0
20	4	0	0	2,0 ± 0,5	0
24	4	1,3 ± 0,1	2,0 ± 0,8	0	2,0 ± 0,6
28	4	4	2,6 ± 0,3	2,0 ± 0,1	2,0 ± 0,1
32	4	2,6 ± 0,3	4	2,0 ± 0,5	4
40	4	2,5 ± 0,8	0,7 ± 0,5	4	4
52	4	3,0 ± 0,2	4	4	4

Оценка выживаемости спермиев при 38 °С выявила аналогичные закономерности. В норме выживаемость спермиев после криоконсервации должна быть не менее 5 часов, что оценивается в 0,5 балла. Выживаемость криоконсервированной спермы от быков, облучённых в дозах 3-4 Гр, резко снизилась до 0, начиная с 4 недели после облучения. Восстановление выживаемости спермиев в этих группах наблюдали лишь через 40-48 недель, практически через 1012 месяцев после облучения. Выживаемость спермиев при облучении быков в дозе 1 Гр на 4 неделе была в пределах нормы (0,5 балла). Однако уже на 8 неделе она снизилась до 0,3±0,05 балла и далее с 10 по 30 недели была равна 0 (табл. 5).

Таблица 5 Выживаемость спермиев после криоконсервации (балл)

Недели	Доза, Гр
	0	1	2	3	4
0	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
4	0,5	0,5	0,2 ± 0,01	0	0
8	0,5	0,3 ± 0,1	0	0,2	0
12	0,5	0	0	0	0
16	0,5	0	0	0	0
20	0,5	0	0	0	0
24	0,5	0	0	0	0
28	0,5	0	0,3 ± 0,1	0,2 ± 0,1	0
32	0,5	0,8 ± 0,1	0	0,5	0
40	0,5	0	0,2 ± 0,1	0,3 ± 0,1	0
52	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

При облучении быков-производителей в дозе 2 Гр снижение выживаемости спермиев после криоконсервации зарегистрировали на 4 неделе до 0,2±0,01 балла, далее отмечали полную гибель спермиев, восстановление этого показателя наблюдали лишь через 34 недели после облучения (8 месяцев). Сперма, полученная от быков-производителей, облучённых в дозах 1-4 Гр, не выдерживает криоконсервации на протяжении 8-12 месяцев после облучения.

Заключение

Таким образом, облучение быков-производителей в сублетальных дозах вызывает длительное нарушение сперматогенеза и, как следствие, снижение воспроизводительных качеств. Глубина нарушений и срок восстановления показателей сперматогенеза зависят от дозы облучения. Анализ подвижности, концентрации и процента мёртвых спермиев позволяет с достаточной точностью определить сроки и глубину нарушения воспроизводительной способности облучённых самцов сельскохозяйственных животных. Так, облучение быков-производителей в дозах 1-2 Гр вызывает через 2 месяца снижение воспроизводительных качеств (на срок 3-4 месяца) примерно на 50%. Облучение в более высоких дозах 3-4 Гр вызывает нарушение воспроизводительных качеств уже через месяц после облучения на 60-70% (длительностью 8-10 месяцев). Через 8-10 месяцев после облучения в дозах 1-2 Гр невозможно получать сперму, пригодную после размораживания для искусственного осеменения коров. При облучении быков-производителей в дозах 3-4 Гр не наступает полного восстановления качества спермы и получение замороженных спермодоз практически невозможно в течение года после облучения. Соответственно использование быков-производителей для промышленного животноводства будет невозможно, что приведёт к увеличению затрат на содержание быков, уменьшению выхода приплода и отрицательно повлияет на экономические составляющие ведения животноводства в целом.