Влияние волоконного ВКР-лазера на эритроциты крыс

Введение. К настоящему времени лазерное излучение прочно вошло в медицинскую практику. Прежде всего это высокоинтенсивное лазерное излучение, используемое в хирургии для нанесения поверхностных и глубоких разрезов, испарения поверхностных дефектов кожи, коагуляции и карбонизации тканей, их стерилизации. Достаточно высока терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), наблюдаемая при лечении самого широкого круга заболеваний. В сочетании с фотосенсибилизатором НИЛИ применяется для избирательного разрушения опухолей (фотодинамическая терапия [3]). Однако метод фотодинамической диагностики и терапии в силу ряда вполне объективных причин остается уделом единичных специализированных учреждений. В основе причин ограничения широкого использования этого метода лежат: 1) необходимость введения экзогенных фотосенсибилизаторов; 2) высокая их фототоксичность; 3) длительность периода накопления фотосенсибилизатора опухолью (24–48 часов) и длительность снижения его концентрации в здоровой ткани; 4) относительная тропность к некоторым доброкачественным опухолям; 5) возможность аллергических реакций и высокая стоимость фотосенсибилизаторов [9] ^∗ .

^∗ Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009–2013 гг.»

В течение ряда лет защищается идея, согласно которой инфракрасный свет (λ=1264±4 нм) может напрямую возбуждать молекулы кислорода в биологических системах и тем самым вызывать регулирование метаболизма или даже гибель клеток («свето-кислородный эффект») [4; 5]. Исследования в этом направлении основываются на гипотезе профессора Р.В. Амбарцумяна о механизме генерации синглетного кислорода при возбуждении линий поглощения молекулярного кислорода [1].

Для подтверждения гипотезы была проведена серия экспериментов на суспензиях эритроцитов, микробах, клеточных культурах опухолей и солидных опухолях животных [4; 5; 6; 7]. Авторы отмечают, что наиболее высокая биологическая активность лазерного воздействия, особенно на опухоли, наблюдается на длине волны 1268 нм. Для получения устойчивого цитотоксического эффекта требуется увеличение плотности импульсной мощности [7]. Полученные данные являются обоснованием для совершенно нового метода лечения онкологических заболеваний – прямой фотохимической деструкции опухолей без использования экзогенных сенсибилизаторов.

Для создания мощных источников возбуждения синглетного кислорода наиболее простым представляется ВКР-преобразова-ние излучения иттербиевого волоконного лазера [8]. Эффект вынужденного комбинаци- онного рассеяния (ВКР) – нелинейный эффект, который становится сильным в протяженных волоконных световодах за счёт концентрации интенсивного излучения на большой длине [2].

Научным центром волоконной оптики РАН совместно с Ульяновским государственным университетом разработан уникальный непрерывный иттербиевый волоконный ВКР-лазер с рабочей мощностью до 5,5 Вт и длиной волны 1,26–1,27 мкм. Его характеристики должны помочь реализовать идею прямой фотодинамической терапии [8].

Для эффективного и безопасного лечения необходимы четкие представления о механизме действия этого физического фактора на биологическую систему. Эффекты лазерного излучения часто изучаются на стандартном модельном объекте – эритроцитах. О состоянии их мембран можно судить по системе «перекисное окисление липидов (ПОЛ) – антиоксиданты (АО)». Литературных данных, посвященных воздействию ВКР-лазеров на эритроциты, мы не обнаружили.

Цель исследования. Оценка уровня ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной системы защиты в эритроцитах при высокоинтенсивном непрерывном лазерном воздействии.

Материалы и методы. Исследования проводились на эритроцитах белых крыс. Рабочая взвесь эритроцитов ресуспендирова-лась в 0,85 % NaCl в соотношении 1:1 и помещалась в пластиковую кювету. Облучение велось волоконным ВКР-лазером (λ=1265 нм) непрерывно с максимальной выходной мощностью 5,5 Вт. При этом дозы, получаемые суспензией эритроцитов составили: 7,8; 10,8; 39; 54; 78; 108; 156 и 216 Дж/см2. Интенсивность ПОЛ оценивалась спектрофотометрически с учетом разведения (1:100). В эритроцитах определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) по Л.И. Андреевой (1988); активность каталазы, глутатион-S-трансферазы (ГТ) по А.И. Карпищенко (1999) и супероксиддисмутазы (СОД) по Nishikimi (1972). В надосадочной жидкости гемоглобинцианидным методом определялся уровень гемоглобина. Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента (в Stata 6.0). Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты представлены в табл. 1. Важным показателем функционального состояния мембран клеток является интенсивность процессов липопе-роксидации в них. Нами было изучено влияние высокоинтенсивного непрерывного облучения на процессы липопероксидации мембран эритроцитов по уровню МДА. Проведенные исследования показали, что значения МДА при лазерном облучении в дозах 7,8, 39 и 78 Дж/см² остаются на уровне контрольных значений. При других используемых нами параметрах облучения наблюдается выраженное усиление липопероксидации эритроцитарных мембран, о чем свидетельствует достоверно значимое повышение МДА по сравнению с контролем.

Высокоинтенсивное лазерное излучение активизировало ферментативное звено антиоксидантной защиты. Наиболее выраженным и достоверным оказалось повышение уровня активности СОД, катализирующей дисмута-цию супероксида в кислород и пероксид водорода. При этом динамика дозозависимого изменения активности фермента носила волнообразный характер. Активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов также возрастает при всех используемых дозах высокоинтенсивного ВКР-лазерного облучения. При этом уровень данного фермента постепенно нарастает и достигает максимума при дозе воздействия 39 Дж/см2, а затем постепенно снижается, достигая контрольного уровня при дозе 216 Дж/см2. В результате исследования было установлено, что облучение ВКР-лазером при дозе 7,8 Дж/см2 не активизировало каталазу. Более высокие дозы высокоинтенсивного лазерного облучения вызывают повышение активности данного антиоксидантного фермента.

Возможно, в инициации наблюдаемого свободно-радикального окисления участвует синглетный кислород, образовавшийся в результате прямой фотогенерации:

- 'O2 ('Д,,г = 0) ^ 3O2 (’s8> = 0) +

Таблица 1

Состояние системы «ПОЛ – АО» в эритроцитах при воздействии ВКР-лазером

Примечание. * – различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,05).

При развитии фотоотклика клетки происходит смена трех последовательных стадий, которые при достаточно большой дозе воздействия проявляются последовательно одна за другой. Реакция клетки на воздействие облучения начинается стереотипным возбуждением и проявляется в синхронном увеличении мембранной лабильности. Продолжающееся облучение приводит к нарастанию в клетке окисления, что вынуждает клетку перейти к активной самозащите (ферментативная борьба с окислением молекулярных структур). При возрастании фотодинамической нагрузки наступает третья фаза фотоотклика клетки – повреждение системы ионного транспорта и осмотическое набухание клетки. В результате уменьшается концентрация всех молекул и тормозятся биохимические процессы. Продолжающееся воздействие приводит к критическому набуханию клетки и наступает ее разрыв [4].

О повреждении мембран эритроцитов при лазерном воздействии свидетельствует достоверное повышение уровня гемоглобина в надосадочной жидкости. Следует отметить небольшой спад уровня гемоглобина в надосадке при дозе облучения 156 и 216 Дж/см2 по сравнению с более низкими дозами воздействия, что может быть связано с термиче- ской денатурацией гемоглобина при данных режимах воздействия [9].

Заключение. Воздействие высокоинтенсивного непрерывного лазерного излучения с используемыми параметрами усиливает процессы липопероксидации мембран эритроцитов и стимулирует активность ферментов антиоксидантной защиты.

• 6.    Иванов, А.В. Физические основы лазерных методов в онкологии : дис. … д-ра физ.-мат. наук / А.В. Иванов. – М., 2003. – 359 c.

• 7.    Корси, Л.В. Лазерный способ фотохимической деструкции опухолей без экзогенных сенсибилизаторов / Л.В. Корси, В.Г. Соколов // Лазерно-оптические системы и технологии : сб. ст. – М., 2009. – С. 101–106.

• 8.    Курков, А.С. Волоконный ВКР-лазер для прямой фотодинамической терапии / А.С. Курков. – Режим доступа : phch.mrsu.ru/2009-2/pdf/2Kurkov.pdf.

• 9.    Прокопьев, В.Е. Биофизические механизмы воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на биологические ткани и оптические методы диагностики их состояния : дис. … д-ра физ.-мат. наук / В.Е. Прокопьев. – Томск, 2004. – 282 с.

• 10.    Ямайкина, И.В. Денатурация гемоглобина – первая стадия термогемолиза эритроцитов / И.В. Ямайкина, Е.А. Черницкий // Биофизика. – 1989. – Т. 34, №4. – С. 656–659.

THE EFFECT OF FIBER RAMAN-LASER ON ERYTHROCYTES OF RATS

L.V. Poludnyakova1, T.P. Gening1, L.A. Belozerova2

1Ulyanovsk State University, 2Ulyanovsk State Pedagogical University