Влияние живого корма на активность пептидаз пищеварительного тракта и состав крови у стерляди Acipenser ruthenus (L.)

В последние десятилетия ихтиофауна большинства водоемов Планеты подвергается зна чительному антропогенному стрессу. Загрязня- Скворцова Елена Гамеровна, кандидат биологических наук, доцент, заведующая кафедрой зоотехнии ФГБОУ ВО Ярославская ГСХА.

ющие вещества оказывают негативное влияние на морфологию, биохимические и физиологические процессы, а также пищевое поведение, размножение, развитие, рост и выживаемость рыб (Alabaster, Lloyd, 1980; Лукьяненко, 1983; Moore, Ramamoorthy, 1984; Флеров, 1989; Высоцкая, Немова, 2004; Scheuhammer et al., 2007; Кузьмина, 2008; Flint et al., 2012; Corrales et al., 2015). Помимо этого, поллютанты вызывают у рыб стресс-реакцию (Кузьмина, 2008). Это обстоятельство настоятельно требует увеличения товарного воспроизводства рыб за счет активного развития аквакультуры. Ранее основными объектами аквакультуры в нашей стране были карп (Щербина, Гамыгин, 2006) и форель (Остроумова, 2012). Однако в настоящее время наибольшей опасности подвергаются рыбы реликтового сем. осетровых Acipenseridae, находящиеся на грани полного исчезновения.

Вследствие этого предпринимаются меры для восстановления и увеличения популяций осетровых рыб, а также увеличения их воспроизводства в условиях аквакультуры (Гераскин, 2006; Рамазанова, Абдуллаева, 2017). При этом особое внимание уделяется изучению состава кормов и процессов пищеварения у рыб этого семейства (Неваленный и др., 2003; Бедняков и др., 2011; Бедняков, 2014).

Одним из важнейших объектов рыборазведения является стерлядь – наиболее скороспелый вид осетровых (Бедняков, 2014; Рамазанова, Абдуллаева, 2017), некогда широко распространенный в бассейнах Черного, Каспийского и Балтийского морей (Никольский, 1954). Вместе с тем сведения об активности ферментов, реализующих процессы пищеварения у стерляди, фрагментарны (Кузьмина, Кузьмина, 1991; Бедняков, 2014; Кузьмина и др., 2015). Поскольку наибольшую роль в процессах пищеварения играет протеолиз (ферментативный гидролиз амидных связей в белках и пептидах), наибольшую роль в гидролизе и ассимиляции белковых компонентов играют пептидазы пищеварительного тракта рыб, объектов их питания и энтеральной микробиоты (Barrington, 1957; Fange, Grove, 1979; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005; 2015; Bakke et al., 2011). Как известно, активность протеолитических ферментов у рыб разных видов различна и в значительной мере зависит от спектра питания и состава пищи. В последнее время большое значение придается вкладу в процессы пищеварения ферментов объектов питания рыб (Kuz’mina, 2008). Однако сведения, касающиеся добавок живого корма на комплекс физиолого-биохимических показателей стерляди, выращиваемой в условиях аквакультуры, в доступной литературе отсутствуют. Вместе с тем об эффективности добавок живых кормов можно судить не только по активности пищеварительных гидролаз, но и по гематологическим показателям, отражающим изменения, происходящие в организме и помогающие оценить полноценность кормов (Житенева и др., 1989; Рыжков и др., 1998; Бахарев и др., 2015; Рамазанова, Абдуллаева, 2017).

Цель работы состояла в изучении влияния добавок живого корма на активность пептидаз, гидролизующих белковые компоненты корма рыб, а также гематологические показатели стерляди, выращиваемой в экспериментальных условиях.

МЕТОДИКА

Работа проведена в лаб. мониторинга и контроля качества и на базе кафедры зоотехнии ФГБОУ ВО Ярославская ГСХА в течение 2017 г. Объект исследования – клинически здоровые годовики стерляди Acipenser ruthenus L. Молодь стерляди была получена из икры на ООО «Ры- боводный завод Ярославский» и доставлена в ФГБОУ ВО Ярославская ГСХА в январе 2017 г. Рыбы содержались в бассейне объемом 7 м3. 1/10 часть воды ежедневно заменяли на свежую. Температура воды 18 ± 2 ºС. В качестве корма рыбы ежедневно получали комбикорм марки Coppens (SteCo PRIME-17), 3 % от массы тела. Плотность посадки – 4,3 экз./м2. Основные гидрохимические параметры воды соответствовали рыбохозяйственным нормативам: температура воды 16–20 ºС, рН – 7,1–7,5, содержание кислорода – 3,5–10 мл/л.

Опыты по влиянию живого корма на физиолого-биохимические показатели начались 1 июля. Сразу после вылова у 5 экз. рыб, рассматриваемых в качестве контроля, из хвостовых сосудов отбирали кровь в пробирки, содержащие раствор антикоагулянта ЭДТА-К2 (этилендиаминтетраацетат) с концентрацией 1.95 мг ЭДТА-К2 на 1 мл крови. Затем быстро проводили морфометрический анализ и изымали висцеральные органы, которые помещали в морозильную камеру, где они хранились в течение 2-х суток при температуре -20ºС. После этого 1% массы комбикорма заменили равным количеством личинок хирономид Chironomus sp. массой 4,4 мг. 19-го июля был снова проведен морфометрический анализ и взяты пробы тканей у 5 экз. рыб, рассматриваемых в качестве опыта. Затем количество вводимых в корм хирономид увеличили до 2%. Корм такого состава рыбы получали в течение 1-го месяца. 18-го августа снова был проведен морфометрический анализ и взяты пробы тканей 5 экз. рыб, рассматриваемых в качестве опыта.

Гематологический анализ проводили по следующим показателям: подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов, определение содержания гематокрита, подсчет лейкоцитарной формулы. Состав и соотношение лейкоцитов изучали на мазках крови и мазках кроветворных органов, которые фиксировали этиловым спиртом. Для определения соотношения лейкоцитов мазки окрашивали азур-эозином по Романовскому (1 капля основного раствора на 1 см3 дистиллированной воды, рH 6.8–7.0). При идентификации лейкоцитов использовали «Атлас клеток крови рыб» (Иванова, 1982). Под микроскопом МИКМЕД-6 на каждом мазке крови подсчитывали 200 клеток, выделяя лимфоциты, моноциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, промиелоциты, ми- елоциты, метамиелоциты; на мазках-отпечатках органов почек, селезенки и печени подсчитывали 200 клеток, выделяя: гемоцитобласты, лимфоциты, плазмоциты, макрофаги, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы. Количество лейкоцитов и эритроцитов подсчитывали в камере Горяева под микроскопом МИКМЕД-6 по стандартным методикам. Гематокрит определяли стандартным методом с использованием пипеток Панченкова в 100 мкл цельной крови (Кондрахин, 2004).

Данные обрабатывали статистически с использованием приложения EXCEL программы MS Office’XP. Достоверность различий результатов (средняя и ошибка среднего) оценивали по критерию Стьюденту для малых выборок при р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Масса и длина годовиков стерляди недостоверно увеличилась после введения в корм рыб 1% личинок хирономид (табл. 1). После увеличения содержания в корме личинок хирономид до 2% масса увеличилась незначительно, длина и обхват рыб сохранились на прежнем уровне.

Таблица 1. Морфометрические показатели стерляди, n = 5

Дата	Масса рыбы, г	Масса порки, г	Длина рыбы, см	Обхват рыбы, см
01.07.2017	145±15,7	126±14,1	29,6±1,8	11,6±1,0
19.07.2017	168±22,2	141±18,8	36,0±1,3	12,5±0,6
18.08.2017	176±24,1	149±21,5	36,6±2,3	12,0±0,8

Таблица 2. Масса и длина желудочно-кишечного тракта стерляди, n=5

Гематологические показатели крови стерляди (табл. 4) варьируют в пределах нормы для данного вида рыб (Сырбулов, 2003; Лепилина и др., 2006). Важно отметить достоверное увеличение по сравнению с контролем количества лейкоцитов в крови рыб опытных групп стерляди, получавших дополнительно к основному рациону личинок хирономид, что может указывать на улучшение их физиологического состояния.

Состав и соотношение лейкоцитов в крови стерляди свидетельствует о не зависящем от состава корма лимфоидном характере (табл. 5). Второе место по численности занимают нейтрофилы, среди которых превалируют сегментоядерные формы. Незрелые гранулоциты (промиелоциты и миелоциты) в крови не выявлены. Важно отметить стойкую тенденцию к увеличению количества метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов.

Полученные значения лейкоцитов характерны для рыб сем. осетровых (Лепилина и др., 2006; Рамазанова, Абдуллаева, 2017). Состав и соотношение лейкоцитов, характеризующих состояние клеточного звена неспецифического иммунитета (Житенева и др., 2001; Гордеев и др., 2017), а также преобладание зрелых форм гранулоцитов в периферической крови рыб свидетельствует о нормальном протекании физиологических процессах организма у всех групп стерляди (Житенева и др., 2001, Кузина, 2011).

Изучение состава и соотношения лейкоцитов в кроветворных органах (мезонефросе, селе-

Таблица 4. Основные гематологические показатели стерляди, n=5

Дата	Гематокрит, %	Лейкоциты, тыс./мкл	Эритроциты, млн./мкл
01.07.2017	24,2±2,92	35,2±1,34	1,28±0,09
19.07.2017	25,2±2,48	42,4±3,34*	1,24±0,04
18.08.2017	24,4±1,82	42,8±2,57*	1,26±0,03

* Различия между контролем и опытом достоверны

Таблица 5. Состав лейкоцитов в крови сеголеток стерляди, тыс./мкл (n =5)

Тип лейкоцитов	01.07.2017	19.07.2017	18.08.2017
Лимфоциты	87,6±1,44	85±1,90	85,2±1,39
Моноциты	3,2±0,22	4,0±1,00	3,2±0,23
Метамиелоциты	2,0±0,61	2,6±0,57	2,8±0,22
ПЯН	1,8±0,89	2,2±0,42	3,0±0,61
СЯН	2,4±0,27	2,8±0,65	3,0±0,94
Эозинофилы	3,0±0,79	3,4±0,84	2,8±0,42

Примечание. Здесь и в табл. 6: ПЯН - палочкоядерные нейтрофилы, СЯН - сегментоядерные нейтрофилы зенке, печени) стерляди показало, что большую 89.0% соответственно (табл. 6), считающиеся часть иммунокомпетентных клеток составля- главными клетками иммунной системы (Горде-ют лимфоциты: 77.8-79.0%, 85.6-86.6% и 88.0- ев и др., 2017; Хаитов и др., 2002).

Таблица 6. Соотношение лейкоцитов в кроветворных органах сеголеток стерляди, %, (n =5)

Тип лейкоцитов	01.07.2017	19.07.2017	18.08.2017
Мезонефрос (туловищная почка)
Гемоцитобласты	4,80±0,41	6,40±1,25	4,20±0,65
Промиелоциты	1,20±0,55	0,80±0,22	1,60±0,27
Миелоциты	1,20±0,42	1,00±0,35	1,40±0,27
Метамиелоциты	1,10±0,19	2,00±0,22	1,30±0,24
Плазмоциты	1,60±0,45	0,80±0,22	0,80±0,22
ПЯН	2,20±0,41	3,00±0,94	3,00±0,61
СЯН	2,20±0,20	3,00±1,10	2,80±0,50
Эозинофилы	2,80±0,55	2,80±0,89	3,00±0,50
Макрофаги	3,80±0,82	4,00±1,06	2,80±0,42
Лимфоциты	77,80±2,10	77,40±3,59	79,00±1,66
Селезенка
Гемоцитобласты	1,80±0,42	2,40±0,67	2,20±0,55
Промиелоциты	1,60±0,76	1,80±0,65	1,40±0,84
Миелоциты	1,00±0,35	1,20±0,42	0,80±0,42
Метамиелоциты	0,60±0,45	1,00±0,87	0,80±0,65
Плазмоциты	0,80±0,42	0,20±0,22	0,840±0,44
ПЯН	1,80±0,42	2,00±0,71	1,60±0,57
СЯН	2,00±0,50	1,60±0,45	1,80±0,45
Эозинофилы	2,00±0,35	1,60±0,27	1,80±0,22
Макрофаги	2,80±0,65	2,60±0,67	2,60±0,57
Лимфоциты	85,60±2,17	85,80±2,13	86,60±2,82
Печень
Гемоцитобласты	1,20±0,54	1,60±0,45	1,40±0,57
Промиелоциты	0,20±0,22	0	0
Миелоциты	0,40±0,27	0,20±0,22	0,20±0,22
Метамиелоциты	0,80±0,42	0,80±0,22	0,40±0,27
Плазмоциты	0	0,20±0,22	0
ПЯН	1,80±0,42	1,60±0,45	1,40±0,57
СЯН	2,00±0,71	2,20±0,65	2,20±0,82
Эозинофилы	2,40±0,76	3,00±1,46	2,60±0,91
Макрофаги	3,00±0,50	2,40±0,27	2,60±0,27
Лимфоциты	88,00±0,61	88,40±0,76	89,00±1,32

Доля этих клеток у рыб во всех исследуемых группах возрастает в ряду мезонефрос – селезёнка – печень. При этом в мезонефросе содержится наибольшее количество гемоцитобластов – 4,8–6,4%. Доля этих клеток в селезенке составила 1,8–2,4, в печени – 1,2–1,6%. Зрелые нейтрофилы в кроветворных органах всех групп стерляди, как правило, представлены сегментоядерными формами. Их относительное содержание в мезонефросе несколько выше (2,2–3,0%), чем в печени (2,0–2,2%) и в селезенке (1,6–2,0%). Относительное содержание эозинофилов в мезонефросе и в печени близко (2,8–3,0 и 2,4–3,0%), в селезенке ниже – 1,6–2,0%. Относительное количество макрофагов также выше в мезонефросе (2,8–4,0%), чем в печени (2,4–3,0%) и в селезенке (2,6–2,8%). Самой многочисленной группой созревающих клеток в мезонефросе и селезенке являются промиелоциты: 0,8–1,6 и 1,4–1,8% соответственно. В печени незрелые формы клеток встречались крайне редко, что соответствует данным литературы, причем их обнаружение этом органе объясняется попаданием из сосудистого русла (Ла-пирова и др., 2016).