Внеклеточная ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из донных осадков озера Байкал

Автор: Лаврентьева Е.В., Потапова З.М., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е.

Журнал: Вестник Бурятского государственного университета. Философия @vestnik-bsu

Статья в выпуске: 3, 2007 года.

Бесплатный доступ

Активность внеклеточного фермента изучалась в микроорганизмах, выделенных из донных отложений Байкала. Установлена связь между внеклеточной активностью и типом субстратов и временем культивирования.

Короткий адрес: https://sciup.org/148183707

IDR: 148183707

Текст научной статьи Внеклеточная ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из донных осадков озера Байкал

Выделение микроорганизмов различных физиологических групп: протеолитиков, амилоли-тиков и целлюлозоразлагающих проводили на среде Пфеннига с добавлением соответствующих субстратов (практикум по микробиологии, 1976).

В качестве источника секретируемых внеклеточных ферментов, использовали культуральную жидкость (КЖ), Секретируемую внеклеточную протеолитическую активность определяли с помощью метода Эрлангера и др. (1961), используя синтетические субстраты БАПА (п-нитроанилид "Н-бензоил-РЬ-аргинин), ГААЛП (Glp-ала-ала-лей-п-нитроанилид), а также с помощью метода тринитрофенилирования (ТНБС), используя 1%-ый белковый субстрат (желатин). Активность целлюлазного комплекса определяли на различных целлюлозосодержащих субстратах спектрофотометрическим методом. Редуцирующие сахара определяли по методу Шомодьи-Нельсона (Билай, 1982),

Результаты и их обсуждение. •

Физико-химические условия донных осадков озера Байкал, откуда были выделены накопительные и чистые культуры протеолитических и целлюлозоразлагающих бактерий, приведены в таблице 1. Культуры микроорганизмов были исследованы на способность секретировать внеклеточные протеолитические ферменты на различных белковых субстратах, при их различных концентрациях и в зависимости от времени культивирования.

Таблица 1 Физико-химическая характеристика донных осадков

Станция	Глубина водной толщи, м	Описание образцов	Горизонт, см	Т°С	рн	Культура
В-ОЗ-7	1310	Коричневый песок	2-5	4-6	7,6	1/2
В-03-3	1350	Темно серая глина	5-10	6-7	7,9	5/2
В-03-4	1340	Темная серая глина	7-8	7-5	7,5	6/2
В-03-8	1350	Серая глина	12-20	7-5	7,5	9/2
В-ОЗ-З	1300	Светло-серая глина	20-30	5-3	7,3	10/2
В-03-9	1340	Серая глина	1540	4-7	7,5	11/2

Выполненные нами исследования донных осадков глубоководных районов Южного Забай калья выявили наличие повышенных значений протеазной активности микроорганизмов.

Работа поддержана грантами Министерства образования и науки РФ «Биогенное минералообразование термофильным микробным сообществом»; Президиума СО РАН №58; Президиума РАН № 99.

Определение трипсинподобной протеолитической активности

Культуры микроорганизмов были исследованы на способность секрегировать внеклеточные протеолитические ферменты на различных белковых субстратах, при различных концентрациях.

По результатам проведенных исследований установлено, что наибольшая трипсин подобная активность определяется на 3 сутки (601,47 мкг/мл в мин.) в культуре 1/2, со станции В-03-3-1, выращенной на среде, с концентрацией пептона - 1,5% (табл. 2). Пик внеклеточной активности пришелся на 2-3 сутки, что коррелирует с накоплением биомассы. В биотехнологии этот факт позволит использовать экзогенный белок в индукции механизма продукции внеклеточных протеаз.

Таблица 2

Трипсинподобная протеазная активность бактерий, мкг/мл в мин

Сутки	Культура	1/2		5/2	6/2	9/2	10/2	11/2
1	2	3		4	5	6	7	8
	1,5%п	553.39		363.83	422.99	75.85	475.61	151.26
	2%п	39.94		159.66	479.22	94.24	46.41	136.92
2	1,5%ж	22.04		19.07	48.96	315.89	20.92	46.73
	2%ж	177.37		155.39	297.80	15.45	11.80	51.35
	1,5%к	11.03		47.47	41.00		12.27	49.22
	2%к	7.22		44.48	44.70	——	38.03	45.00
	!.5%п	601.47		100.34	140.72	48.99	105.11	122.01
	2%п	100.93		36.71	166.93	61.79	92.10	133.03
	1,5%ж	32.93		68.87	105.14	68.09	25.96	83.56
3	2%ж	57.09		81.66	311.49	35.53	45.97	61.6!
	1,5%к	23.51		24.41	43.46	——--	16.32	22.37
	2%к	32.89		58.32	42.54	——	21.62	41.21
	1,5%п	47.66		39.36	53.72	53.63	37.61	58.10
	2%п	63.26		45.05	59.95	52.05	47.19	70.81
4	1,5%ж	31.50		45.51	63.44	45.58	31.49	52.41
	2%ж	58.21		51.20	63.44	45.58	31.49	52.41
	1,5%к	40.90		24.71	62.14	——	29.00	64.52
	2%к	49.76		51.04	54.76	——	33.55	75.46
	1.5%п		40.96	34.44	50.06	36.36	66.96	24.48
	2%п		60.43	75.15	67.05	45.26	70.56	119.72
5	1.5%ж		67.48	53.95	68.35	59.53	53.79	66.61
	■ 2%ж		87.71	52.81	70.86	82.17	116.06	46.88
	1,5%к		45.94	21.91	267.55		37.20	22.69
	2%к		87.66	26.12	95.12	—	57.15	27.44

Примечание:

«ж» - желатин; «к» - казеин; «п» - пептон ч------»- не определено

Таким образом, проведенные исследования на субстрате ВАРА показали, что все культуры проявили активность. Наиболее высокая активность характерна для культур, выращенных на среде с пептоном.

Определение субтилизинподобной протеолитической активности

По результатам проведенных исследований установлено, что наибольшая субтилизинлодоб-ная активность определена на 2 сутки (249,76 мкг/мл в мин.) в культуре 1/2, со станции В-ОЗ-З-I, выращенной на среде, с концентрацией казеина - 2% (табл. 3)

Исходя из общей картины эксперимента, максимальная субтилизинподобная активность проявлена культурой 6/2 на 2-3 сутки культивирования.

Определение протеолитической активности методом тринитрофенилирования По результатам проведенных исследований установлено, что выделенные культуры в большей степени являются активными продуцентами протеаз. Все культуры показали высокие значения протеолитической активности. Установлено, что наибольшая активность определена на 3 сутки (2874,08 мкг/мл в мин.) в культуре 1/2 со станции В-ОЗ-З-1, выращенной на среде с концентрацией пептона - 1,5%. (табл. 4).

Субтилизинподобная протеазная активность бактерий, мкг/мл в мин.

Сутки	Культура	1/2	5/2	6/2	9/2	10/2	11/2
1	2	3	4	5	6	7	8
	1,5%п	195,36	218,11	145,4	6,05	42,13	127,23
	2%п	37,1	118,14	123,92	45,44	49,72	87,24
	1,5%ж	35,9	15,33	15,9	84,82	19,18	16,26
2	2%ж	140,45	35,34	159,04	20,5	4,07	40,1
	1,5%к	11,65	25,86	45,44	.......	5,82	32,77
	2%к	249,76	118,14	209,02		35,34	(99,87
	1,5%п	4,84	22,72	17,75	42,55	37,63	186,24
	2%п	186,24	70,88	113,6	29,74	86,33	120,41
3	1,5%ж	61,79	21,28	99,14	34,08	75,73	27,96
	2%ж	23,58	49,98	86,33	29,6	55,53	56,54
	1,5%к	53,39	60,58	349,88		9,69	57,93
	2%к	18,17	12,58	24,15		9,08	9,64

	1.5%п	9,08	21,03	13,06	10,09	13,32	16,35
	2%п	16,35	18,17	17,9	62,1	9,69	16,27
5	1,5%ж	15,14	21,67	17,64	16,66	14.26	29,68
	2%ж	21,97	25.16	4,1	49,07	18,25	6,05
	1,5%к	13,92	21,38	18,57	.......	13,38	16,05
	2%к	21,78	16,19	19,39		7.86	23,01

Примечание;

«ж» - желатин; «к» казеин; «п» - пептон

«-----» - не определено

Таблица 4

Протеолитической активности методом тринитрофенилирования, мкг/мл в мин.

Сутки	Культура	1/2	5/2	6/2	9/2	10/2	11/2
	1,5%п	2075,75	1235,96	1226.88	132,07	2417,4	836,09
	2%п	205,99	613,44	1115,34	223,06	233,2	494,38
2	1,5%ж	148,66	151,65	152,79	817,92	133,79	152,58
	2%ж	1131,86	1362,2	664,33	53,59	84,29	204,48
	1,5%к	35,28	192,94	194,34		38,62	204,1
	2%к	40,89	197,88	193,12	—	197,62	193.12
	1,5%п	2874,08	443,49	618,48	202,41	561.18	545,28
	2%п	448,94	141,49	503,97	185.54	461,97	429,93
3	1,5%ж	143,79	186,3	355,94	170,74	142,49	250.42
	2%ж	284	375,63	1126,9	150,25	282,86	224,47
	1,5%к	140,86	208,68	143,13	.......	89,79	150,25
	2%к	140,86	208,68	143,13	.......	89.79	150,25
	1,5%п	95,12	84,63	106,71	15,9	90,88	99.01
	2%п	108,19	50,68	80,18	92,09	74,72	80,18
5	1,5%ж	82,42	92,09	58,47	53.47	59,45	95,12
	2%ж	59,22	59,82	114,33	84,99	40,69	61,66
	1,5%к	48,77	66.5	60,08	------	37,46	87,55
	2%к	45,14	92,06	77,39	—	86,9	89,68

Определение белка в культуральной жидкости (ЮК) по Бредфорд показало, что максимальное количество выделенного белка составляет 0,32 мкг/мл на 2 сутки в культуре 10/2, выращенной на 1,5% казеине (табл. 5). Нами установлена обратная зависимость протеазной активности и концентрацией белка. Так, при низкой концентрации белка характерна высокая активность протеаз.

Содержание белка по Бредфорд, мкг/мл

Сутки	Культура	1/2	5/2	6/2	9/2	10/2	11/2
1	2	3	4	5	6	7	8
	1,5%п	0,006	0,01	0,0!	0,045	0,005	0,015
	2%п	0,06	0,02	0,011	0,055	0,025	0,081
	1,5%ж	0,08	0,08	0,015	0,09	0,081	0,011
2	2%ж	0,009	0.01	0,195	0,145	0,06	0,23
	1,5%к	0.065	0,065	0,129		0,32	0,056
	2%к	0,3	0,062	0.064	—	0,004	0,025
	1,5%п	0,018	0.055	0,02	0,02	^Г 0.025	0,079
	2%п	0,022	0,06	0,024	0,026	0,079	0,06
	!,5%ж	0,03	0,066	0,081	0,045	0.04	0,03
3	2%ж	0,01	0,075	0.04	0,03	0.13	0.13
	1,5%к	0,079	0.175	0,08		0,054	0.08
	2%к	0,066	0,06	0,075	———	0,067	0,063
	1,5%п	0,13	0,085	0.09	0,086	0,075	0,122
4	2%п	0,13	0,12	0,075	0,122	0,12	0,062
	1,5%ж	0,085	0,114	0,112	0,15	0.1!	0J2I
	2%ж	0,188	0,082	0,156	0,077	0,091	0,08
	1,5%к	0,079	0,112	0,058		0,115	0.093
	2%к	0,115	0,078	0,18	-----	0,073	0,095
	1,5%п	0.058	0,113	0,098	0,058	0,11	0,12
	2%п	0,09	0,126	0,18	0,106	0.094	0,18
5	1,5%ж	0,106	0,092	0,028	0,115	0,06	0,116
	2%ж	0,142	0,27	0,028	0,148	0,2	0,082
	1,5%к	0,176	0,073	0,045	—-----	0,071	0,035
	2%к	0,106	0,115	0,03	———	0,1	0,12

Примечание:

«ж» - желатин; «к» - казеин; «п» - пептон

«------» - не определено

Проведенные исследования показывают зависимость протеолитической активности от концентрации белкового субстрата, быстрое снижение измеряемой активности после достижения максимума, что, вероятно, связано с истощением субстратов в среде, вследствие чего утрачивается необходимость в поддержании определенного уровня гидролизующего субстраты фермента. Также выявлена закономерность пика активности в зависимости от времени культивирования (2-3 сутки). Использование различных синтетических субстратов для определения активности показало возможность выделенных культур секретировать ферменты семейства сериновых протеаз. Важным моментом является то, что синтез и секреция протеаз представляют собой регулируемый процесс.

Определение целлюлазного комплекса

Нами была изучена целлюлазная активность факультативно анаэробных целлюлолитиков. Поскольку микроорганизмы продуцируют целлюлазный комплекс высокой и низкой молекулярной массы, который содержит эндолюканазу, экзоглюканазу, а при гидролизе целлюлозы оба комплекса образуют целлобиозу, которая разрушается под действием /З-глюкоидазной активности.

Определение экзоглюконазной активности

Высокая активность данных ферментов обнаружена в культуре 10/2, выделенной с 0-10 см горизонта донных осадков (табл 6). Из общей картины эксперимента видно, что пик активности приходится на 6 сутки в культурах, выращенных на средах с концентрацией КМЦ- 2%.

Таблица 6

Экзоглюканазная активность бактерий, мкг/мл глюкозы

Сутки	Культура	1/3	10/2	9/2	2/5	1/2
2	Ф.Б.	0,25	0,35	0,35	0.1	0,3
	1,5%КМЦ	1,3	0,6	0,85	0,8	1,55
	2%ШЦ	0,45	1,95	0.4	0,33	1,25

3	Ф.Б.	0,45	0,25	0,1	0,7	0.5
	К5%КМЦ	1,75	4,45	0J	0,1	1,65
	2%КМЦ	1,27	0,65	0,5	0.7	1,5
4	Ф.Б,	1,65	13	0,95	2.9	0,35
	13%КМЦ	1,15	3,45	2.15	2,55	2,3
	2%КМЦ	1,75	4.1	1,75	0,7	2,5
5	Ф.Б,	0,72	0,65	1,3	2,85	1,4
	1,5%КМЦ	L4	035	1.97	L6	2.85
	2%КМЦ	1,4	3,4	1,97	2,05	2,65
6	Ф.Б.	0,75	0,6	1,8	1,5	0,7
	1.5%КМЦ	1,45	03	1,0	1.06	1,03
	2%КМЦ	2.25	5,73	5	2,65	3.65

Примечание:

Ф.Б. - фильтровальная бумага;

КМЦ - карбокси метил целлюлоза.

Из представленных данных видно, что концентрация 2% КМЦ стимулировала активность экзоглюканазы практически во всех культурах.

Определение эндоглюканазной активности

По результатам проведенных исследований установлено, что наибольшая активность определена на 6 сутки (9,4 мкг/мл глюкозы) в культуре 10/2 со станции BGC-6-03-1, горизонт 0-10 см, выращенной на среде с концентрацией КМЦ - 2% (табл. 7).

Эндоглюканазная активность бактерий, мкг/мл глюкозы

Таблица 7

Сутки	Культура	9/2	1/3	2/5	1/2	10/2
	ФЪ.	0,7	1,5	1,6	1,4	035"
2	1,5%КМЦ	0,5	1,3	2,6	1,4	0,7
	2%КМЦ	1,65	3,65	1,75	1,65	1,05
	Ф.Б.	1,97	2,2	1,6	0,95	1,05
3	1,5%КМЦ	3,55	3,4	2,55	1,3	8,05
	2%КМЦ	1,8	3,5	0,9	4,85	6,55
	Ф.Б.	L4	0,2	2,65	0.35	1,3
4	1,5%КМЦ	2,5	2,25	3,55	3,4	3,15
	2%КМЦ	1,45	3,55	0,95	3,9	7
	Ф.Б.	1,25	1,8	1,3	2,05	0,9
5	1,5%КМЦ	2,55	2,2	L6	6,2	2,65
	2%КМЦ	1,97	L8	2,25	3,75	8,25
6	Ф.Б,	3,55	1,75	0,6	2,1	0,9
	1,5%КМЦ	3,8	4,95	1,5	2,95	9,15
	2%КМЦ	3,9	4,75	2,05	2,9	9,4

Примечание:

ФБ. - фильтровальная бумага;

КМЦ- карбокси метил целлюлоза;

Определение 0-глюкозидазной активности

Исследуемые культуры являются продуцентами ^-глюкозидазы, которые гидролизуют целлобиозу и короткие цепочки целлоолигосахаридов до глюкозы и не оказывают влияние на целлюлозу (Тараканов, Лавлинский, 1999). Следует отметить, что все культуры показали высокую активность /3-глюкозидаз.

По результатам проведенных исследований установлено, что наибольшая /S-глюкозидазная активность обнаружена на 6 сутки (11,6 мкг/мл глюкозы) в культуре 10/2 со станции BGC-6-03-I, горизонт 0-10 см, выращенной на среде с концентрацией КМЦ - 2% (табл. 8).

Результаты исследований показывают, что выделенные культуры микроорганизмов обладают высокоактивным целлюлазным комплексом. Полученные данные позволяют заключить, что активность ферментов целлюлазного комплекса у микроорганизмов зависит от источника гидролизуемой целлюлозы и времени культивирования.

/3-глюкозидазная активность бактерий, мкг/мл глюкозы

Сутки

Культура

1/2

9/2

1/3

10/2

2/5

Ф.Б.

1,5%КМЦ 2%КМЦ

2,3

' 1,5 .

1,8

1,45

2,6

1,65

1,3

1,65

3,15

1,95

2,7 3,05

1,55

0,7

1,3 ■

Ф.Б.

1,5%КМЦ

2%КМЦ

2,8

4,45

6,4

2,6

2,7

2,75

1,4 7

2 5,75 8,1

1,75

1,5

2,7 ■

Ф.Б.

!.5%КМЦ 2%КМЦ

2,3 4,65 7

2,55 5,5

3,55

2,95 1

7,4

2,35 10,6 И

2,7 3 6,55

Ф.Б.

1,5%КМЦ 2%КМЦ

1,25

6,15

6,45

5,1

2,7

4,75

2,4

7.8

1,85

8,85

11,2

1,7

3.55

6.75

Ф.Б.

1,5%КМЦ

2%КМЦ

3,05 7 9,5

6,15

2,2

7,6

2,75

4,65

4.75

1,55

6,8

11,6

2,95

5,2

6,1

Примечание:

Ф.Б. - фильтровальная бумага;

КМЦ- карбоксиметил целлюлоза;

Список литературы Внеклеточная ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из донных осадков озера Байкал

Намсараев Б.Б,. Земская Т.И Микробиологические процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал. -Новосибирск: Изд. СО РАН, филиал «Гео». -2000. -160 с.
Намсараев Б.Б., Дулов Л.Е. Микробные сообщества озера Байкал//Биоразнообразие Байкальской Сибири. Новосибирск: Наука, 1999. -350 с.
Практикум по микробилогии: учеб, пособие. -/под ред. Н.С. Егорова. -М.: Изд-во Московского ун-та, 1976. 307с.

Статья научная