Внутриклеточный кальций и цАМФ опосредуют кардиотропные эффекты агонистов опиоидных рецепторов

Интерес исследователей к участию опиоидных рецепторов (ОР) в формировании устойчивости миокарда к действию ишемии и реперфузии в последние годы значительно возрос. Доминирующими типами ОР в миокарде являются δ- и κ-рецепторы [19], которые, в свою очередь, подразделяются на соответствующие субтипы: δ1 и δ2, κ1 и κ2[6, 23]. Однако значение этих рецепторов и внутриклеточные сигнальные системы, опосредующие их влияние на регуляцию сердечной деятельности в норме и при ишемии-реперфузии, окончательно не определены. Данные одних авторов свидетельствуют об участии опиоидов в регуляции сократительной функции миокарда [8, 20], а результаты других указывают на отсутствие инотропных эффектов после активации ОР [3]. Нет однозначного мнения и о том, как влияет стимуляция δ- и κ-ре-цепторов на насосную функцию сердца в условиях возобновления коронарной перфузии. Нет полной яснос- ти и относительно роли названных рецепторов в формировании устойчивости миокарда к действию ишемии и реперфузии. Имеются лишь отдельные публикации о том, что после предварительной активации δ- и κ-ОР замедляется формирование необратимых повреждений кардиомиоцитов в условиях коронароокклюзии in vivo [16,17]. Вместе с тем, по данным других авторов [3], κ-агонист бремазоцин, напротив, усугубляет ишемические и реперфузионные повреждения сердца.

Внутриклеточные механизмы, реализующие кардио-тропные эффекты опиоидов, изучены также недостаточно. Известно, что активация ОР может приводить к снижению образования цАМФ в сердце и интактных кардиомиоцитах [22]. Именно с этим феноменом некоторые авторы связывают кардиопротекторное действие, оказываемое опиоидами в условиях ишемии-реперфузии сердца [1, 3]. В свою очередь, циклический АМФ играет важную роль в регуляции транспорта Са2+ в клетках сердца [14]. Известно, что избыточное увеличение концентрации этого катиона в миоплазме во время ишемии служит одной из причин развития необратимых повреждений кардиомиоцитов [11]. Согласно данным К. Вентура с соавт. [20], δ- и κ-ОР участвуют в регуляции транспорта кальция в кардиомиоцитах на уровне саркоплазматического ретикулума. Однако исследований кальцийрегулирующей роли опиоидных рецепторов в условиях ишемии-реперфузии миокарда до сих пор никем не проводилось.

Настоящая работа посвящена исследованию роли δ ₁- и κ ₁-опиоидных рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии-реперфузии; оценке вклада цАМФ и внутриклеточного Ca²⁺ в реализацию кардио-тропных эффектов агонистов этих рецепторов.

Материал и методы

Эксперименты проведены на изолированных перфузируемых по Лангендорфу сердцах крыс-самцов линии Вистар массой 250–300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Тотальную нормотермическую ишемию миокарда моделировали посредством полного прекращения подачи перфузионного раствора на 45 мин, возобновляли коронарную перфузию и продолжали наблюдение в течение 30 мин.

В ходе опыта регистрировали частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин), давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт. ст.), конечное диастолическое давление (КДД, мм рт. ст.). Степень повреждения кардиомиоцитов оценивали по уровню креатинфосфокиназы (КФК) в объеме раствора, прошедшем через сердце за период реперфузии. Активность КФК определяли с помощью энзиматических наборов “CK-NAc” компании Biocon Diagnostik (Vohl/Marienhagen, Германия). Конечный результат выражали в мкмоль NADH/мин в пересчете на 1 г ткани сердца за 30 мин реперфузии (U/г).

Для активации ОР по окончании 20-минутной адаптации сердца к условиям нормоксической перфузии и за 20 мин до моделирования ишемии в раствор Кребса–Хен-зелайта добавляли один из агонистов ОР в конечной концентрации 0,1 мкМ/л. После 10-минутной перфузии с препаратом сердце “отмывали” от лиганда в течение еще 10 мин. Стимуляцию δ ₁-ОР проводили с помощью селективного δ ₁-агониста H-Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen-OH (DPDPE) [6], активацию κ ₁-ОР селективным κ ₁-агонистом trans(±)-3,4-Dichloro-N-methyl-N-[2-(1-pyrrolidinyl) cyclohexyl] benzeneacetamide HCl (U-50.488) [10]. Опиоиды растворяли в физиологическом растворе перед началом опыта.

Для изучения процессов внутриклеточного транспорта Са2+ была проведена отдельная серия экспериментов с ингибитором Са2+-АТФ-азы саркоплазматического ретикулума (СПР) циклопиазоновой кислотой в конечной концентрации 100 нМ [5]. Эксперименты проводили по вышеизложенной схеме. Контролем служили изолированные сердца, которые после 40-минутного стабилизационного периода подвергали тотальной ишемии (45 мин) с последующей реперфузией (30 мин).

Содержание циклического АМФ в ткани миокарда оп- ределяли с помощью стандартных коммерческих радиоиммунных наборов “RIA AMPc/cAMP” (компания “Immunotech”, Марсель, Франция). Результаты всех проведенных экспериментов обработаны статистически с применением критерия Манна–Уитни.

Результаты

В контрольной группе тотальная ишемия приводила к полной остановке сердца, а возобновление коронарной перфузии сопровождалось неполным восстановлением его насосной функции и повреждением кардиомиоцитов. Значения силы и частоты сердечных сокращений во время реперфузии были ниже исходных на 50% и 60% соответственно, а конечное диастолическое давление возросло почти в 3 раза по сравнению с доишеми-ческим уровнем (рис. 1). До ишемии выход КФК из миокарда составлял в среднем 5,5 U/г, а после реперфузии этот показатель увеличился в 4 раза (22,5 U/г).

Было установлено, что активация δ ₁- и k₁-опиоидных рецепторов снижает частоту и силу сердечных сокращений в доишемическом периоде. Так, ДРЛЖ через 10 мин после введения в перфузат d₁-агониста DPDPE достоверно уменьшалось на 40%, КДД возрастало на 50% по сравнению с исходным уровнем (рис. 1 б, в). Через 10 мин от начала перфузии интактных сердец раствором Кребса– Хензелайта, содержащим κ ₁-агонист U-50.488H, отмечалось уменьшение ЧСС (на 33%) и ДРЛЖ – на 47% по сравнению с исходным уровнем (рис. 1 а, б). Статистически значимых изменений КДД после стимуляции κ ₁-рецеп-торов мы не отметили (рис. 1 в).

После применения агонистов δ ₁- и κ ₁-ОР (DPDPE и U-50.488) содержание цАМФ, измеренное в ткани сердца через 10 мин перфузии, не отличалось от показателей контрольной группы (рис. 2а).

Активация δ ₁- и κ ₁-опиоидных рецепторов сопровождалась усилением реперфузионной сократительной дисфункции сердца. После стимуляции δ ₁-ОР частота и сила сокращений в реперфузионном периоде были примерно в 2 раза ниже соответствующих контрольных величин (рис. 1 а, б). При этом средние значения КДД статистически достоверно не отличались от соответствующих величин в контрольной группе, превышающих исходные показатели в 2,5 раза (рис. 1 в). Активация κ ₁-ОР с помощью U-50.488 также вызывала стойкое снижение ЧСС в постишемическом периоде на 27% от значений в контрольной группе. Применение κ ₁-агониста приводило к уменьшению ДРЛЖ (рис. 1). Постишемического увеличения КДД по сравнению с контролем не наблюдалось.

Воздействие ишемии и реперфузии на сердца крыс контрольной группы сопровождалось развитием необратимых повреждений кардиомиоцитов, о чем косвенно свидетельствовало 4-кратное (по отношению к доише-мическому уровню) увеличение активности креатинки-назы в растворе, оттекающем от сердца во время реперфузии (рис. 2 б). После стимуляции δ ₁- или κ ₁-ОР степень ишемического и реперфузионного повреждения миокарда существенно снижалась.

Доказательством тому послужило снижение реперфузионного выброса креатинкиназы в оттекающий от сер-

KOIII рои.

ГРА+DPDPE

в

Рис. 1. Влияние агонистов δ ₁- и k₁-опиоидных рецепторов DPDPE и U-50.488 на частоту сердечных сокращений (а), давление, развиваемое левым желудочком (б) и конечное диастолическое давление, выраженное в % от исходных показателей (в). СРА – циклопиазоно-вая кислота. Достоверные отличия от контроля: * – р<0,05; отличия от значений до ишемии: # – р<0,05; ## – р<0,01

текторный эффект δ ₁-агониста DPDPE (рис. 2 б). Использование одной циклопиазоновой кислоты не влияло на уровень КФК, КДД, ЧСС, но вызывало снижение ДЛРЖ на 24% по сравнению с контролем в доишемическом периоде.

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение устойчивости сердца к повреждающему действию ишемии-реперфузии связано с активацией δ1- и κ1-ОР. На это указывает уменьшение реперфузионного выброса креатинкиназы, обнаруженное после активации названных рецепторов. Как известно, при необратимых повреждениях мембран кардиомиоцитов некоторые внутриклеточные энзимы поступают в кровь или раствор, которым перфузируют изолированное сердце [9]. При этом гиперфер-ментемия обычно тесно коррелирует с размерами некротического поражения миокарда [9], поэтому снижение реперфузионного выброса КФК в ответ на активацию ОР является косвенным показателем уменьшения количества необратимо поврежденных кардиомиоцитов. Близкие по значению результаты были получены и в работах других исследователей. Так, в экспериментах in vivo было установлено, что внутривенное введение селективных κ-агонистов способствует ограничению зоны реперфузионного некроза миокарда у крыс [16], а стимуляция κ-рецепторов на мембранах изолированных кардиомиоцитов сопровождается сни- дца раствор, на 32 и 48% соответственно по сравнению с контролем (рис. 2 б).

На 30-й мин реперфузии содержание цАМФ в миокарде снижалось в 2 раза в ответ на стимуляцию κ ₁-ОР и не изменялось после использования δ ₁-агониста (рис. 2 а).

Мы предположили, что кардиопротекторное действие δ1-агониста связано с изменением транспорта кальция в миоплазму из СПР, и провели эксперименты с циклопиа-зоновой кислотой (блокатором Са2+-АТФ-азы СПР). Применение названного ингибитора устраняло кардиопро- жением степени повреждения последних при аноксии-реоксигенации [21]. В то же время в экспериментах на изолированных перфузируемых сердцах крыс показано, что κ2-агонист бремазоцин вызывает увеличение размеров зоны некроза сердечной мышцы [3]. Следует заметить, что авторы, применявшие κ1-агонисты, обнаружили повышение устойчивости сердца действию ишемии-реперфузии [16, 17], а исследователи, использовавшие in vitro κ2-агонист бремазоцин, наблюдали усиление ишемического и реперфузионного повреждения сердца [3]. Возможно, противоречия обусловлены существованием

Рис. 2. Уровень цАМФ в миокарде после предварительной стимуляции κ ₁- и δ ₁-опиоидных рецепторов с помощью U-50.488 и DPDPE (а); активность креатинфосфокиназы в перфузионном растворе после предварительной стимуляции κ ₁- и д₁-опиоидных рецепторов с помощью U-50.488H и DPDPE (б). Статистически значимые отличия от контроля: * – р<0,05; отличия от значений до ишемии: # – р<0,05; ## – р<0,01

на мембранах кардиомиоцитов двух субтипов κ -опиоид-ных рецепторов ( κ ₁ и κ ₂) [23]. Мы обнаружили цитопро-текторный эффект κ ₁-агониста U-50.488H в концентрации 0,1 мкМ, обеспечивающей взаимодействие этого лиганда только с κ ₁-ОР [7]. Приняв во внимание данные об ингибирующем эффекте κ -агонистов на активность аде-нилатциклазы [22] и, соответственно, на синтез цАМФ, мы предположили, что в реализации кардиопротекторного эффекта U-50.488H определяющую роль играет снижение образования цАМФ в миокарде во время ишемии и реперфузии.

Механизм защитного действия κ1-агониста представляется следующим. Известно, что один из основных способов повышения выживаемости клеток сердца при ишемии заключается в уменьшении потребности миокарда в кислороде [15]. Имеются данные о прямом стимулирующем действии цАМФ на активность ферментов митохондрий: сукцинатдегидрогеназы и НАД(Ф)+-трансгидроге-назы [2]. Исходя из известного постулата об увеличении утилизации кислорода в процессе окислительного фосфорилирования, логично предположить, что обнаруженное нами κ1-опиоидергическое снижение образования цАМФ во время ишемии и реперфузии будет способствовать уменьшению потребности миокарда в кислороде и, в конечном итоге, приведет к замедлению формирования необратимых повреждений кардиомиоцитов [15]. Следовательно, кардиопротекторный эффект U-50.488H опосредуется через уменьшение уровня цАМФ.

Однако мы не обнаружили существенного влияния d₁-агониста на содержание цАМФ в миокарде. Следовательно, цитопротектор-ный эффект, наблюдаемый после активации кардиальных δ ₁-ОР, не связан с изменением внутриклеточного уровня цАМФ. Мы предположили, что эффект обусловлен опиоидерги-ческим изменением транспорта кальция в клетке. В пользу этого предположения говорит тот факт, что DPDPE в период, предшествующий ишемии, вызывал подъем КДД. Такое изменение диастолической функции сердца принято связывать с увеличением концентрации ионов кальция [Ca²⁺]_i в цитоплазме. Известно, что стимуляция опиоидных рецепторов способствует усиленной мобилизации Ca²⁺ из саркоплазматического ретикулума [20]. Однако чрезмерное увеличение концентрации Ca²⁺ в цитоплазме должно было бы повлечь за собой повреждение кардиомиоцитов в период ишемии-реперфузии по механизму, напоминающему “кальциевый парадокс” [13], чего мы не наблюдали. Напротив, в условиях стимуляции δ ₁-ОР происходило повышение толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии.

Можно предположить два возможных объяснения данному феномену. Первое заключается в том, что стимуляция ОР способствует усиленной мобилизации Ca2+ из саркоплазматического ретикулума [20] с после дующим истощением запасов Ca2+СПР в доишемическом периоде. Подобные изменения кальциевого гомеостаза могут, в принципе, предупреждать Са2+-перегрузку кардиомиоцитов во время ишемии и реперфузии [5, 18], а, следовательно, повышать устойчивость сердца к гипоксии и реоксигенации. В основе другого δ1-опиоидерги-ческого механизма может лежать активация протеинки-назы С, которая катализирует фосфорилирование ряда белков, обеспечивающих повышение устойчивости сердца к ишемии и реперфузии [4]. В свою очередь, повышение активности названного фермента может происходить в ответ на кратковременный подъем [Ca2+]i [12]. Мы установили, что ингибирование Са2+-АТФ-азы СПР циклопи-азоновой кислотой устраняет как подъем КДД в ответ на стимуляцию δ1-ОР, так и кардиопротекторный эффект DPDPE. Между тем известно, что циклопиазоновая кислота способствует истощению запасов Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме [5] с последующим уменьшением [Ca2+]i а мы наблюдали снижение амплитуды сокращений серд, ца в ответ на добавление в перфузат названной кислоты, что можно объяснить уменьшением выброса кальция из СПР. Следовательно, в механизме δ1-рецептор-обусловленной кардиопротекции определяющая роль принадлежит изменению транспорта Са2+ на уровне СПР.

Таким образом, полученные результаты доказывают участие кардиальных δ1- и κ1-опиоидных рецепторов в формировании устойчивости миокарда к повреждающе- му действию ишемии и реперфузии. Кардиопротектор-ное действие U-50.488H связано со снижением уровня цАМФ в миокарде, а аналогичный эффект DPDPE опосредован опиоидергическим изменением транспорта кальция на уровне саркоплазматического ретикулума. Стимуляция δ1- и κ1-рецепторов способствует снижению сократимости изолированного сердца в условиях нормальной оксигенации и усугубляет нарушение систолической функции миокарда при возобновлении коронарной перфузии.

Материалы статьи подготовлены при поддержке грантов Министерства образования и науки (2.1.1/530 и 2.1.1/ 211), РФФИ (грант 10-04-00288-а) и Федерального агентства по науке и инновациям.