Внутриопухолевая морфологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность в астроцитомах разной степени злокачественности в материале от первой операции

История изучения астроцитарных опухолей уходит корнями в середину XIX века, когда Р. Вирхов в 1864 г. впервые представил их макроскопическое описание [1]. Свое название «глиомы» эти опухоли получили за структурное сходство с глией. Сам термин «глиобластома» впервые был введен Strauss и Globus в 1918 г. [2]. Авторы связывали название глиобластомы с недифференцированными «клетками-глиобластами», из которых она состояла. Впервые на полиморфность строения «глиоматозных» опухолей обратил внимание В.В. Веденгаммер [3]. Морфологической вну-триопухолевой гетерогенности посвятил несколько своих работ Л.И. Смирнов, в них он отметил наличие не просто фенотипически отличных клеток в опухоли, но и участков разной степени зрелости [4, 5]. На многообразие клеточного состава и присутствие в опухоли компонентов разных тканевых элементов указывали и отечественные, и зарубежные исследователи первой половины ХХ века, ещё задолго до того, как появились первые предположения о влиянии гетерогенности на резистентность опухоли к проводимой адъювантной терапии [4, 6–9]. В настоящее время научный интерес смещается от изучения фенотипических особенностей к познанию генетической гетерогенности злокачественных астроцитом.

Последние годы ознаменовались активным развитием молекулярной биологии, усовершенствованием стандартов лечения, диагностики и динамического наблюдения за пациентами, однако продолжительность жизни по-прежнему остается невысокой. Показатели 5-летней выживаемости больных диффузной астроцитомой GII (ДА) составляют 50,1 %, анапластической астроцитомой GIII (АА) – 29,8 %, первичной глиобластомой GIV (ГБ) – 5,5 %. Работы, посвященные молекулярной генетике, пролили свет на патогенетические механизмы возникновения этих новообразований, а также выявили предиктивные и прогностические биомаркеры, имеющие существенное клиническое значение [10–16].

Согласно данным немногочисленных исследований, ключевыми причинами развития рецидива заболевания рассматриваются наличие гетерогенности в опухоли, нарушение работы систем репарации ДНК и присутствие плюрипотентных стволовых опухолевых клеток с заведомо неизвестной их дифференцировкой в процессе эволюции самой опухоли. Именно поэтому интерес к морфологической и молекулярно-генетической гетерогенности в опухоли только растет [17–19]. Однако обнаружить морфологическую гетерогенность опухоли можно лишь при исследовании интраоперационного материала, полученного из нескольких точек опухолевого узла. В зарубежных работах, посвященных данной проблеме, оптимальное число исследуемых образцов опухолевой ткани составляет от трех до шести [20, 21].

Цель исследования – определить наличие морфологической и молекулярно-генетической гетерогенности в первичной глиобластоме, анапластической астроцитоме и диффузной астроцитоме.

Материал и методы

Проведено проспективное исследование 22 больных в возрасте 18 лет и старше с впервые диагностированной нейроэпителиальной опухолью супратенториальной локализации, в том числе 8 мужчин. Всеми пациентами подписано информированное согласие на участие в данном исследовании, одобренном этическим комитетом.

Пациентам было выполнено хирургическое удаление опухоли со степенью циторедукции от субтотального до практически тотального удаления, которые оценивались посредством интраоперационной УЗ-навигации и МРТ с контрастным усилением в раннем послеоперационном периоде. Под макроскопически тотальным удалением понималась резекция опухоли 95 % и более, под субтотальным – 80–94 %. Интраоперационно проводился забор фрагментов опухолевой ткани из пяти равноудаленных точек с минимальным расстоянием между ними 15 мм под контролем УЗ-навигации и флюоресцентной микроскопии с использованием 5 АLA (рис. 1). Кусочки опухоли помещались в пробирки с 10 % нейтральным формалином с соответствующей их маркировкой по локализации с последующим изготовлением парафиновых блоков по стандартной методике. Гистологический диагноз ставился в соответствии с классификациями ВОЗ опухолей ЦНС (2007/2016) в каждом фрагменте опухолевой ткани. Всем больным выполнялось иммуногистохимическое исследование (ИГХ) c использованием антител GFAP (poly, DakoCytomation) и Ki67 (MIB-1, DakoCytomation), а при необходимости: Syn (27G12, DakoCytomation), NB (NB84A, Leica), CD99 (12E7, DakoCytomation). На первом этапе проводился анализ гистологических препаратов с окрасками: гематоксилин и эозин, Ki-67, GFAP. В части случаев (при наличии примитивного нейроэктодермального компонента в опухоли) составля-

Рис. 1. Точки интраоперационного забора материала для определения внутриопухолевой гетерогенности

Fig. 1. Intraoperative sampling points for determining intratumoral heterogeneity

лась панель для второго этапа ИГХ-исследования с постановкой окончательного диагноза в каждом фрагменте опухолевой ткани. При оценке цитоплазматического окрашивания антителами GFAP, Syn, NB, CD99 пользовались полуколичественным методом: 0 – окрашивание отсутствует, 1+ – слабое окрашивание, 2+ – умеренное окрашивание, 3+ – интенсивное окрашивание. При ядерном окрашивании антителом Ki67 определялся процент окрашенных клеток к их общему числу.

Для молекулярно-генетического исследования с блока производился прицельный забор опухолевых клеток с минимальным объемом информативного

Мутации в генах IDH1 (экзон 4) и IDH2 (экзон 4) в опухолевой ткани детектировали при помощи анализа кривых плавления ПЦР-продуктов с высоким разрешением (HRMA – High Resolution Melting Analysis) с последуюшим секвенированием ДНК.

Результаты

Внутриопухолевая морфологическая гетерогенность была изучена у 22 больных (110 парафиновых блоков) (табл. 1). Первичная ГБ была диагностирована у 16 больных, АА – у 5, и ДА – у одного пациента. В 16 (72,7 %) случаях из 22 была выявлена внутриопухолевая морфологическая гетерогенность. Таким образом, в первичной ГБ она присутствовала в 68,8 % (11/16), в АА – в 80 % (4/5) и в единственном случае ДА. Ровно в половине случаев опухоль была гетерогенна в 3 и более фрагментах из 5 (50 %).

Ниже приводится описание клинического случая (табл. 1, 19) с морфологической гетерогенностью в опухоли (рис. 3–7). Представленный случай имел разнообразную морфологическую картину: «мозг», «диффузная астроцитома GII» и «анапластическая астроцитома GIII». Окончательный диагноз – анапластическая астроцитома GIII.

Внутриопухолевая молекулярно-генетическая гетерогенность была изучена в 8 случаях (2 случая – АА и 6 – ГБ). Всего проанализировали 40 фрагментов опухолевой ткани (по 5 фрагментов из каждого опухолевого узла), из них в 7 не удалось выделить достаточное количество РНК для проведения анализа. Таким образом, молекулярногенетическое исследование удалось выполнить в 33 фрагментах опухолевой ткани, и в каждом определялся уровень экспрессии мРНК генов MGMT, ERCC1, PDGFR-α, VEGF, TOP2A, C-kit и материала 85 %. Относительная экспрессия мРНК генов TP, ERCC1, TOP2A, MGMT, VEGF, C-kit, PDGFR-α определялась при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на оборудовании CFX96 Real-Time PCR мутации в генах IDH1 и IDH2 (табл. 2).

Изменение уровней экспрессии шести генов изучено в 48 экспрессионных анализах. Уровни экспрессии мРНК большинства генов ( PDGFR-α, VEGF, TOP2A, MGMT ) в разных фрагментах одного

Рис. 2. Метод определения экспрессии мРНК – ПЦР в режиме реального времени. а) высокий уровень экспрессии; б) низкий уровень экспрессии (∆Ct<0,7 – высокий; 0,7<∆Ct< 3 – средний; ∆ Ct=> 3 – низкий)

Fig. 2. A method for determining the expression of mRNA – real time PCR. a – a high level of expression, b – a low level of expression (ΔCt<0,7 – high; 0,7<ΔCt<3 – medium; Δ Ct =>3 – low)

Таблица 1/table 1

-D

I— О О

ф о о. ф I— ф

г*

Ф с Ф ГО 2 ф ф

О

С

Ж S к

ксУ

S

Ы)

о с; о -8-О. О 5

О X О. Н > Z CD

Ъ) о о

О.

О Е о Е э

2 с

3 S

щ

2 о с

Note: DA – diffuse astrocytoma GII; AA – anaplastic astrocytoma GIII; GB – primary glioblastoma GVI; Ki67 – proliferative index; PNET – primitive neuroectodermal tumor; n.a. – no information available.

в 87,5 % (7/8). Таким образом, в общей сложности уровни экспрессии мРНК всех изучаемых генов отличались в 41,7 % (20/48) (в табл. 2 выделены цветом) и оказались без изменений в 58,3 % случаев.

Генетическая гетерогенность отсутствовала только при определении мутаций в генах IDH1 и IDH2. Мутация была выявлена в гене IDH1 (R132H) в 50 % (4/8) случаев – в двух первичных ГБ и двух АА (табл. 2). В пяти из восьми исследуемых случаев наблюдалась морфологическая гетерогенность в опухоли с разной пролиферативной активностью (Ki67). Отметим, что Ki67 порой существенно отличался в рамках одного случая. Морфологическая гетерогенность отличалась большей частотой, чем молекулярно-генетическая (72,7 % и 41,7 % соответственно).

Обсуждение

Актуальность изучения гетерогенности в первичных опухолях ЦНС с годами усиливается, и связано это в первую очередь с растущей заболеваемостью и неизбежным рецидивированием астроцитом, которые составляют более 50 % от всех нейроэпителиальных опухолей. Внутриопухо-левая гетерогенность злокачественных астроцитом вполне может объяснить наличие первоначальной резистентности опухоли к лечению и развитие рецидива заболевания даже после достижения объ-

Рис. 3. Морфологическая гетерогенность. Правый полюс: а – мозг; окраска гематоксилином и эозином, ×100;

б – мозг; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (0–1 %), ×100; в – фрагмент диффузной астроцитомы GII и анапластической астроцитомы GIII с плотноклеточностью; окраска гематоксилином и эозином, ×100;

г – фрагмент диффузной астроцитомы GII и анапластической астроцитомы GIII; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (5–6 %/8 %), ×100 Fig. 3. Morphological heterogeneity. Right pole. a – the brain. Hematoxylin-eosin staining; ×100. b – the brain. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (0–1 %); ×100. с – fragment of diffuse astrocytoma GII and anaplastic astrocytoma GIII with hypercellularity. Hematox-ylin-eosin staining; ×100. d – fragment of diffuse astrocytoma GII and anaplastic astrocytoma GIII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (5–6 % / 8 %); ×100

Рис. 4. Морфологическая гетерогенность. Левый полюс: а – диффузная астроцитома GII с явлением нейро-нофагии; окраска гематоксилином и эозином, ×100; б – диффузная астроцитома GII; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (3–4 %), ×100; в – анапластическая астроцитома

GIII; плотноклеточность, пролиферация сосудов; окраска гематоксилином и эозином, ×100; г – анапластическая астроцитома GIII; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (6–8 %), ×100

Fig. 4. Morphological heterogeneity. Left pole. a – diffuse astrocytoma GII with the phenomenon of neuronophagy; Hema-toxylin-eosin staining; ×100. b – diffuse astrocytoma GII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (3–4 %); ×100. c – anaplastic astrocytoma GIII. Hypercellularity, vascular proliferation. Hematoxylin-eosin staining; ×100. d – anaplastic astrocytoma GIII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (6–8 %); ×100

Рис. 5. Морфологическая гетерогенность. Центр: а – диффузная астроцитома GII с микрокистозом; окраска гематоксилином и эозином, ×100; б – диффузная астроцитома GII с микро-кистозом; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (2–3 %), ×100; в – анапластическая астроцитома

GIII; пролиферация сосудов, плотно-клеточность; окраска гематоксилином и эозином, ×100; г – анапластическая астроцитома GIII; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (6–8 %), ×100

Fig. 5. Morphological heterogeneity. Center. a – diffuse astrocytoma GII with microcystosis. Hematoxylin-eosin staining; ×100. b – diffuse astrocytoma GII with microcystosis. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (2–3 %); ×100. c – anaplastic astrocytoma GIII. Vascular proliferation, hypercellular-ity. Hematoxylin-eosin staining; ×100. d – anaplastic astrocytoma GIII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (6–8 %); ×100

Рис. 6. Морфологическая гетерогенность. Задний полюс: а – фрагмент диффузной астроцитомы GII и анапластической астроцитомы GIII с плотно-клеточностью; пролиферациия сосудов на границе ДА и АА; окраска гематоксилином и эозином, ×100; б – диффузная астроцитома GII; ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (2–3 %), ×100;

в – анапластическая астроцитома GIII. ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (8–9 %), ×100 Fig. 6. Morphological heterogeneity. Dorsal pole. a – fragment of diffuse astrocytoma GII and anaplastic astrocytoma GIII with hypercellularity. Vascular proliferation at the border of DA and AA. Hematoxylin-eosin staining; ×100.

b – diffuse astrocytoma GII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki-67 antibody (2–3 %), ×100; с – anaplastic astrocytoma GIII. Immunohistochemistry, nuclear staining with Ki-67 antibody (8–9 %); ×100

Рис. 7. Передний полюс: а – анапластическая астроцитома GIII, плотноклеточ-ность, пролиферация сосудов, окраска гематоксилином и эозином, ×100; б – ИГХ-исследование, ядерное окрашивание антителом Ki67 (6–8 %), ×100 Fig. 7. Morphological heterogeneity.

Anterior pole. a – anaplastic astrocytoma GIII hypercellularity, vascular proliferation.

Hematoxylin-eosin staining; ×100;

b – immunohistochemistry, nuclear staining with Ki67 antibody (6–8 %); ×100

Таблица 2/table 2

Окончание таблицы 2/end of table 2

ективного ответа на терапию первой линии. Еще в 1937 г. при микроскопическом исследовании обратили внимание на то, что в структуру глиобластомы могут входить как элементы всего астроцитарного ряда, так и эмбриональной опухоли («медулло-бласты») [23–25]. В нашем исследовании была диагностирована глиобластома с примитивным нейроэктодермальным компонентом с индексом пролиферативной активности Ki67 до 80–90 % в участках эмбриональной опухоли и позитивной окраской антителами Syn и NSE в ней (табл. 1, случай 14). Фенотипическая гетерогенность ДА, АА и первичной ГБ при гистологическом исследовании подтверждена в 72,7 % случаев (16/22). Иногда в рамках одного новообразования опухоль имела черты «диффузной астроцитомы GII» и «глиобластомы GIV» с соответствующим им индексом пролиферативной активности (Ki67). Так, в случае ГБ с примитивным нейрональным компонентом были участки опухоли с картиной «диффузной астроцитомы GII» и индексом пролиферативной активности в них 2–3 % и Ki67 около 80–90 % в фокусах примитивного нейроэктодермального компонента. Интересным также представляется более частое присутствие гетерогенности в АА (80 %) по сравнению с ГБ (68,8 %). Наличие гетерогенности в опухоли необходимо учитывать при заборе опухолевого материала во время операции. По результатам нашего исследования в 50 % случаев опухоль была гетерогенна в 3 и более фрагментах. В связи с чем во избежание ошибочного гистологического диагноза число фрагментов опухолевой ткани, забираемых интраоперационно, должно быть от трех и выше.

Молекулярно-генетическая гетерогенность изучается на разных уровнях (на клеточном и в опухоли человека), разными методиками и с целой мозаикой изучаемых генов [19, 26, 27]. В немногочисленных публикациях подтверждается наличие генетической гетерогенности в одной опухоли для разных генов: MGMT, PDGFR-α, EGFR, MET [17, 28–30]. В нашем исследовании изучались изменения экспрессии генов репарации ДНК – MGMT, ERCC1 и онкогенов – PDGFR-α, VEGF, C-kit, а также TOP2A. Удалось выяснить, что уровни экспрессии генов MGMT, ERCC1, PDGFR-α, VEGF, TOP2A, C-kit чаще были стабильными и различались в 41,7 % случаев (20/48) в рамках одного опухолевого узла, и только в одном случае (№ 6) уровень экспрессии мРНК гена ERCC1 был в категории от «низкого» до «высокого» (табл. 2). Возможно, только в данном наблюдении речь идет об истинной гетерогенности, поскольку на небольшие колебания экспрессии «низкий-средний» или «высокий-средний» теоретически мог повлиять процент опухолевых клеток в образцах. Данный методологический аспект мы постарались свести к минимуму, забирая материал для генетического исследования с содержанием опухолевых клеток более 85 %. Разный уровень экспрессии изучаемых генов можно объяснить разным уровнем эволюции и дифференцировки клеток опухоли. Полученный нами результат подтверждается и другими немногими исследованиями, в которых подчеркивается наличие разнообразных экспрессий генов и вариаций числа их копий, что объясняется авторами наличием определенных альтераций для каждого этапа онкогенеза [30–32]. Самой стабильной аберрацией по результатам нашего исследования оказалась мутация в гене IDH1(R132H), которая или присутствовала, или отсутствовала во всех фрагментах опухоли. Данные литературы объясняют это явление тем, что характер мутаций для генов IDH является неслучайным событием, и чаще всего повреждение происходит в одном и том же положении аминокислоты (R132H) [33].

В некоторых исследованиях гетерогенность изучалась при анализе данных, полученных разными методиками изготовления блока (заморозка и фиксация в парафине), а результаты истолковывались как «гетерогенность», когда на самом деле имела место межметодовая дискордантность. Так, например, определяли статус метилирования промотора гена MGMT в образцах опухоли, полученных от 14 пациентов с диагнозом «глиобластома», исследуя 2 фрагмента из каждого опухолевого узла (используя метод заморозки для одного фрагмента и заливку в парафин для другого). В 50 % случаев авторы отметили разные результаты по статусу метилирования [20]. В другом исследовании также при разной методике изготовления блока (заморозка и фиксация в парафине) определяли статус метилирования промотора гена MGMT у 13 больных (c забором по 3 фрагмента из каждого узла). В 30 % случаев (4/13) получили межметодовую несопоставимость, и только в одном – истинную внутриопухолевую гетерогенность [21]. В части работ сравнивались результаты, полученные при разных методах определения активности гена MGMT (ПЦР, ИГХ и др.), также c логичным получением в итоге разных результатов [34, 35]. На наш взгляд, для выявления истинной гетерогенности необходимо соблюсти идентичность лабораторных методик.

Однако оказывается, что не только эволюция клеток на разном уровне приводит в итоге к гетерогенности, но и цитостатическая терапия. B.E. Johnson et al. отметили, что 98,7 % мутаций в ГБ (после рецидива) связаны с терапией темозоломидом, и эти повреждения не были выявлены в первичных опухолях. Таким образом, ХТ темозоломидом способна повлечь за собой темозоломид-индуцированные мутации и гипермутации в лечебно-резистентных субклонах глиобластомы, что может только усилить гетерогенность опухоли при рецидиве [27]. В другом исследовании обнаружили, что гетерогенность опухоли после химиотерапии темозоломидом возрастает в 4 раза [18]. S. Akgül et al. также показали, что частота мутаций увеличивается после лучевой и химиотерапии с (0,2–4,5 %) до (31,9–90,9 %) при трансформации глиом низкой степени злокачественности во вторичные ГБ, при этом остается неясным: рост числа мутаций обусловлен проведенным лечением или является следствием самой анаплазии опухоли [36].

Изучается также влияние микроокружения опухоли на ее гетерогенность, а именно исследуется способность различных клеточных субпопуляций (опухолевых клеток) приобретать свойства стволовых клеток с появлением, в конечном итоге, генетически различных клонов клеток [19, 37, 38]. Эра изучения стволовых опухолевых клеток началась в 90-х годах XX века с их открытия при остром мие-лобластном лейкозе. Спустя несколько лет в опухолях ЦНС (примитивная нейроэктодермальная опухоль (PNET), включая медуллобластому, диффузную астроцитому GII и глиобластому GIV) были обнаружены клетки, которые обладают высокой способностью к самообновлению, пролиферации и дифференцировке. Эти клетки, инициирующие опухоль головного мозга BTICS (Brain tumor-initiating cells), были определены по экспрессии маркера клеточной поверхности CD133 [39, 40]. Y. Ding et al., сравнивая нейронные стволовые клетки и стволовые клетки глиобластомы при выполнении скрининга shRNA kinome, выделили ген BUB1 Mitotic Checkpoint Serine/Threonine Kinase B ( BUB1B ), который играет одну из ключевых ролей в экспансии стволовых клеток глиобластомы, участвуя в регуляции митоза на этапе контрольных точек клеточного цикла [41, 42]. В другой работе, используя данные экспрессионного анализа генов в стволовых клетках ГБ, астроцитах и нервных клетках-предшественниках, разработали классификацию на основании чувствительности опухолевых клеток к ингибированию гена BUB1B [43].

На гетерогенность опухоли также оказывает влияние и микроокружение иммунными клетками. В ткани опухоли присутствуют скопления различных иммунных клеток – лимфоциты, СD4+ и СD 8+, T-клетки, макрофаги [44–46]. В одном исследовании сообщалось о положительном влиянии инфильтрации опухоли T-лимфоцитами на продолжительность жизни пациентов с анапластической астроцитомой, в другом выявили зависимость между степенью инфильтрации B-клетками и выживаемостью пациентов с ГБ [47, 48]. При этом значимых результатов при проведении иммунотерапии опухолей ЦНС пока нет [49].

В последние два года основное внимание уделяется изучению генетической гетерогенности на клеточном уровне. В одной работе проводился анализ молекулярного профиля клонов клеток с определением множества генетических аберраций (CDK4/6, FGFR1, AKT1/2, MTOR, MET, PIK3C2A, WNT5A, SFRP4 и MYC) и активации специфических сигнальных каскадов [36, 50]. В другом исследовании обратили внимание на на- личие в одной опухоли до 4 подтипов ГБ (нейрональный, олигодендроглиальный, астроцитарный и мезенхимальный) [51] и присутствие в разных участках ГБ гетерогенного метилирования ДНК в менее стабильных областях гена [52]. Интересной представляется работа, в которой авторы предположили, что за формирование внутриопухолевой гетерогенности отвечают определенные гены (CYB5R2, TPPP3) и lncRNAs [53].

Таким образом, проведенные исследования по определению внутриопухолевой гетерогенности в ГБ выявили большое число генетических и эпигенетических событий в опухоли, что способствовало выделению в ГБ нескольких биологических подтипов (пронейрального, нейронального, мезенхимального и классического). В основу такого деления положено присутствие в опухоли следующих ключевых признаков: мутации в генах IDH1 и IDH2, наличие или отсутствие метилирования промотора гена MGMT , присутствие мутаций в гене рецептора