Восстановление растений табака после обработки ионами меди

Загрязнение земель ионами тяжелых металлов (ТМ) представляет серьезную экологическую проблему для отраслей сельского хозяйства, приводя к потере урожаев и ухудшению качества продукции [Mohammed et al., 2011].

Некоторые из ТМ являются эссенциальными и в низких концентрациях необходимы для живых организмов. Так, ионы меди обеспечивают поддержание структуры белков, входят в состав каталитических центров ферментов, необходимы для работы электронтранспортных цепей митохондрий и хлоропластов, биосинтеза хлорофилла и т. д. [Yruela, 2005]. Диапазон толерантности живых организмов к ионам меди достаточно узок.

Ионы меди в клетках катализируют образование активных форм кислорода (АФК) в реакциях Фентона и Хабера – Вейса, что ведет к усилению окислительных процессов [Yruela, 2005; Abdelgawad et al., 2020]. У растений избыток Cu2+ в тканях листа вызывает хлорозы, негативно влияет на процессы фотосинтеза и фотодыхания, замедляет скорость роста и прирост биомассы [Yruela, 2005]. Однако после снятия стресса, вызванного действием ионов тяжелых металлов, растения способны восстанавливаться [Drost et al., 2007; Holubek et al., 2020]. Сведений об изменениях маркеров стресса в период последействия неблагоприятных факторов и восстановления роста не так много, в сравнении с данными о прямом действии стрессоров.

Типичным проявлением стресса является рост активных форм кислорода. Количество АФК регулируется ферментативными и неферментативными антиоксидантными системами. Показано, что активность антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы I и III класса, СОД) и накопление низкомолекулярных антиоксидантов зависят от силы и продолжительности действия стрессового фактора [Ku et al., 2012; Chen et al, 2015].

Несмотря на то, что эффекты ионов меди изучены на примере многих растений, далеко не все аспекты роста и физиологии растений после снятия действия стрессора охарактеризованы детально. Цель настоящей работы – изучение последействия разных концентраций ионов меди в среде на размеры органов и антиоксидантный статус растений N. tabacum в длительном модельном эксперименте.

Материал и методы исследования

В качестве объекта использовали растения табака ( Nicotiana tabacum L.), который является модельным и широко используется в лабораторных экспериментах. Растения табака сорта Petite Havana линии SR1 культивировали на предварительно проавтоклавированном субстрате – смесь перлит : вермикулит в соотношении 1 : 1 на среде Кноппа без добавления ионов меди (контроль) и при добавлении CuSO 4 в концентрации 100 (вариант 1) или 300 (вариант 2) мкМ/л в течение первых 20 дней после появления всходов. С 20 по 40 день растения выращивали на среде Кнопа без добавления ионов меди. Фотопериод составил 16/8 (день/ночь), температура 23°С. Все измерения проводили на 40-дневных растениях.

В предварительном опыте по оценке влияния ионов меди на всхожесть семян табака было выявлено, что добавление 100 мкМ Cu2+ стимулировало прорастание семян (28.6% от контроля), не влияло на длину корешка в 5-ти дневных проростках (4.8 мм против 5.0 мм в контроле); при 300 мкМ Cu2+ всхожесть семян не изменилась (-2.8% от всхоже- сти семян в контроле), но уменьшилась длина корешка (1.7 мм против 5.0 мм в контроле), следовательно, обработка этой концентрацией ионов меди ингибировала рост проростков табака. Это обусловило выбор концентраций CuSO4 в данной работе.

Для оценки последействия ионов меди на растения табака измеряли длину корня, стебля, длину и ширину третьего листа (без учета длины черешка). Выборка составила 30 растений для каждой группы. Толщину корня (зона проведения) и стебля (первое междоузлие выше семядолей) измеряли на поперечных срезах с использованием ПО SIMAGIS MesoPlant. Площадь листа рассчитывали как произведение длины на ширину, умноженное на коэффициент k =0.653 [Moustakas and Ntzanis, 1998].

Активность ферментов антиоксидантной защиты определяли в грубом экстракте тканей растений спектрофотометрически. Для получения грубого экстракта навески корней, стеблей и листьев (третий лист) гомогенизировали на холоде в 0.05 М Tris-HCl буфере (pH 7.0), центрифугировали при температуре 4°С.

Активность СОД оценивали по способности фермента ингибировать фотоокисление нитросине-го тетразолия и выражали в усл. ед. / мг бел-ка*мин [Beauchamp, Fridovich, 1971]. Активность ГПО измеряли по скорости окисления гваякола и выражали в мМ гваякола / мг белка*мин [Chance, Maehly, 1955]. Содержание белка в пробах определяли по Бредфорд [Bradford, 1976], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [Zaia et al, 2005].

Грубый экстракт ферментов использовали также для определения содержания Н 2 О 2 с помощью метода, основанного на окислении пероксидом хелатов ксиленолового оранжевого с ионами железа (III) [Bellincampi et al., 2000] и выражали в мкМ пероксида / г сухой массы.

Интенсивность ПОЛ оценивали спектрофотометрически по количеству малонового диальдегида, взаимодействующего с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), и выражали в мкМ ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) / г сухой массы [Uchiyama, Mihara, 1978].

Оптическую плотность растворов при определении активности СОД, ПОЛ, содержания белка и пероксида водорода измеряли в 96-луночном планшете на спектрофотометре Tecan Infinity M 200 Pro («Tecan», Austria), а при определении активности ГПО – на приборе Shimadzu UV-1800 («Shimadzu», Japan).

Измерения проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. Результаты представлены в виде значения среднего арифметического и ошибки. Статистическую обработку данных проводили в программе STATISTICA 10 для

Windows 10 с применением t -критерия Стьюдента, U -критерия Манна-Уитни, непараметрического коэффициента корреляции Спирмена при уровне значимости p < 0.05.

Результаты и их обсуждение

На этапе восстановления после снятия действия ионов меди наблюдали изменение размеров растений N. tabacum (рис. 1, табл. 1).

В варианте 1 (предобработка 100 мкМ Cu2+) длина главного корня была достоверно меньше относительно контроля, однако его толщина в зоне проведения увеличилась. Высота и толщина стебля, площадь листовой пластинки не изменились в этом случае, в сравнении с контролем, тогда как предобработка 300 мкМ Cu2+ привела к статистически значимому уменьшению длины и толщины корня на 14%, высоты и толщины стебля на 14% и 15%, площади листа 39% относительно контроля, соответственно.

Рис. 1 . Морфология растений N. tabacum в период восстановления после снятия действия Cu²⁺

Уменьшение длины главного корня, высоты растений и площади листа является неспецифической реакцией растений на действие тяжелых металлов. У проростков Trifolium repens L. в присутствии 200 мкМ Cu2+ показано 50%-ное уменьшение длины корня [Ермошин и др., 2013]; у Withania somnifera L. длина корня и высота побега также уменьшались [Khatun et al., 2008]. Утолще- ние корня при действии умеренных концентраций Cu2+ рассматривают как адаптивную реакцию, которая способствует увеличению внутренней поверхности корня, связыванию ионов меди в апо-пласте клеток ризодермы и коры [Bouazizi et al., 2010]. Уменьшение диаметра корня при действии высоких концентраций Cu2+ может быть причиной подавления роста клеток растяжением вследствие усиления их лигнификации и снижения эластичности клеточных стенок при связывании их с ионами тяжелых металлов, нарушения транспорта ауксинов и кислого роста, снижения активности экспан-синов [Hamim et al., 2018]. В исследованиях C.M. Cook и соавторов [1997] описано снижение площади листьев у Phaseolus vulgaris L. при действии 160 мкМ ионов меди. При изучении последействия ионов кадмия описано восстановление роста побега и первых листьев растений Glycine max L. У растений, предобработанных более высокими концентрациями Cd2+, отмечали сокращение длины корня как одного из признаков фитотоксичности этого металла [Holubek et al., 2020]. Уменьшение размеров органов растений при избытке ионов тяжелых металлов в среде связывают с накоплением АФК, усилением процессов ПОЛ [Khatun et al., 2008].

В период восстановления после действия ионов меди содержание пероксида водорода было выше в листьях во всех вариантах опыта по сравнению с тканями корня и стебля (табл. 2). В этих органах фотосинтез и дыхание являются источником Н 2 О 2. Несмотря на 20-дневный период восстановления содержание пероксида во всех органах было достоверно выше в сравнении с контрольным вариантом: в варианте 1 (100 мкМ Cu²⁺) в тканях корня выше в 2.1 раза, стебля и листа – в 1.4 раза по сравнению с контролем. В варианте 2 (300 мкМ Cu²⁺) эффекты были выражены сильнее: содержание Н 2 О 2 относительно контроля в корне было выше в 4.5 раза, в стебле – в 1.6 раза и в листе – в 2.3 раза, при уровне значимости различий p = 0.03.

Таблица 1

Влияние последействия ионов меди на размеры органов растений N. tabacum

Вариант (предобработка)	Длина, см		Диаметр, мкм		Площадь листа, мм2
	Корень	Стебель	Корень	Стебель
Контроль (H 2 O)	3.79±0.02	4.93±0.02	739±16	1146 ± 58	443 ± 19
Вариант 1 (100 мкМ Cu2+)	3.25±0.02*	4.77±0.03	820±13*	1100 ± 32	436 ± 19
Вариант 2 (300 мкМ Cu2+)	3.24±0.01*	4.23±0.03*a	634 ± 25*a	971 ± 48*a	268 ± 13*a

Примечание. * – Статистически значимое отличие относительно контроля (p < 0.05); a – статистически значимое отличие относительно условий 100 мкМ ионов меди (p < 0.05).

Наиболее высокий уровень ПОЛ показан в корнях во всех вариантах относительно стебля и листьев. В варианте 1 у предобработанных 100 мкМ Cu2+ растений количество ТБК-РП относительно контроля в тканях корня и стебля было больше в

1.4 и 1.6 раза соответственно, в тканях листа – в 1.1 раза. В варианте 2 этот эффект был выражен сильнее: в тканях корня интенсивность ПОЛ достоверно возросла относительно контроля в 2.1 раза (при p = 0.02). В стебле и листьях этот показа- тель превышал уровень в контроле в 3.7 и 2.9 раза, соответственно (отличие достоверно при p = 0.005).

Мы предполагаем, также как Printz et al, [2016], что в период восстановления растений по- сле действия стрессора, ионы Cu2+, непрочно адсорбированные в клеточных стенках, могли вымываться из них в апопласт и проникать в цитоплазму, вызывая образование АФК.

Таблица 2

Содержание пероксида водорода и ТБК-РП в органах N. tabacum , предобработанных разными концентрациями ионов меди (в расчете на г сухой массы)

Вариант (предобработка)	Корень		Стебель		Лист
	Н 2 О 2 , мкМ	ТБК-РП, мкМ	Н 2 О 2 , мкМ	ТБК-РП, мкМ	Н 2 О 2 , мкМ	ТБК-РП, мкМ
Контроль (H 2 O)	0.71 ± 0.04	7.04 ± 0.25	3.50 ± 0.07	1.57 ± 0.04	8.43 ± 0.08	3.46 ±0.19
Вариант 1 (100 мкМ Cu2+)	1.53 ± 0.13*	9.85 ± 0.42*	4.90 ± 0.19*	2.46 ± 0.19*	11.83 ± 0.36*	3.91 ±0.10*
Вариант 2 (300 мкМ Cu2+)	3.22 ± 0.02*а	15.02 ± 0.28a	5.56 ± 0.17*а	5.03 ± 0.09*a	19.85 ±0.23*a	9.97 ± 0.11*a

Примечание. * – Статистически значимое отличие относительно контроля (p<0.05); a – статистически значимое отличие относительно условий 100 мкМ ионов меди (p<0.05).

Увеличение содержания пероксида водорода и интенсивности ПОЛ в органах табака и, как следствие, развитие стресса, вероятно, и привело к угнетению роста у предобработанных ионами меди растений в сравнении с контролем, что проявилось в уменьшении размеров осевых органов и площади листа. Полученные данные о накоплении АФК и продуктов ПОЛ в условиях последействия Cu2+ свидетельствуют о том, что полного восстановления физиологического состояния растений за 20 дней после действия стрессора не происходит.

Известно, что в поддержание окислительновосстановительного баланса в клетках вовлечены ферментные системы и низкомолекулярные антиоксиданты. Результаты наших исследований показали, что активность СОД статистически значимо снижалась в клетках корня и побега у предобрабо-танных ионами меди растений (рис. 2). Падение активности СОД в ответ на избыток Cu²⁺ в среде описано в растениях Zea mays L., Phyllostachys edulis J. Houz. и, возможно, является следствием инактивации работы фермента продуктом реакции – пероксидом водорода, или нарушения его конформации в результате окислительных процессов [Chen et al, 2015; Abdelgawad et al, 2020]. Возможно, и в условиях последействия ионов меди рост содержания пероксида водорода вызывал продукт-ное ингибирование СОД.

Другой фермент антиоксидантной защиты – ГПО ответственна за утилизацию перекисей. Этот фермент может освобождать клетки от Н2О2, образованного как ферментом СОД, так и другими ферментами, например, гликолатоксидазой. В стеблях и листьях N. tabacum во всех вариантах опыта активность ГПО была ниже, чем в корнях. Увеличение количества Н2О2 в корнях в условиях последействия 100 и 300 мкМ Cu2+ сопровождалось ростом активности ГПО на 90 и 106%, соответственно. При этом в стебле наблюдали снижение активности ГПО на 36% относительно кон- троля только в варианте 2, а в листьях – на 59 и 73%, соответственно, в 1-м и 2-м вариантах опыта (отличие статистически значимо, p = 0.03).

Рис. 2. Активность антиоксидантных ферментов в тканях растений N. tabacum , пред-обработанных разными концентрациями ионов меди:

А – супероксиддисмутаза; В – гваяколовая пероксидаза; * – статистически значимое отличие относительно контроля (p < 0.05); a – статистически значимое отличие относительно условий 100 мкМ ионов меди (p < 0.05)

Возможно, разница в трендах изменения активности ГПО в корнях и надземных органах связана с тем, что корень выполняет барьерную функцию и не позволяет ионам меди в больших количествах транспортироваться в стебель и листья [Cuypers et al., 2016; Abdelgawad et al., 2020]. Следовательно, в этих органах окислительный стресс не так сильно выражен, как в корнях, о чем свидетельствуют более низкие значения содержания ТБК-РП в них в сравнении с корнем. При этом важно отметить, что содержание пероксида водорода в стеблях и листьях больше, чем в корнях и в контроле, и в опытных вариантах. Вероятно, это связано со значительно более высокой активностью ГПО в корнях, быстро расщепляющей Н2О2, чем в стеблях и листьях. Кроме того, зеленые части растений, осуществляющие фотосинтез, имеют дополнительные источники пероксида водорода в фотосинтетической цепи переноса электронов [Abdelgawad et al., 2020] и в гликолатном пути фотосинтеза.

Кроме того, разные изоформы ГПО в корнях и побеге могут отличаться по чувствительности к АФК и продуктам ПОЛ [Maksimovic et al, 2008]. В клетках растений существуют также другие пероксидазы, избавляющие их от Н 2 О 2 .

Роль пероксидаз в реакциях на стресс, вызванный ионами меди, была отмечена у многих растений: Arabidopsis thaliana L. , Oryza sativa L. и др. [Mostofa and Fujita, 2013; Thounaojam et al., 2014].

Показано, что активность ГПО в тканях разных органов зависит от стадии жизненного цикла растений: на стадии вегетации максимальная активность в корнях и низкая в листьях, на стадии бутонизации она возрастает в листьях и снижается в корнях [Maksimovic et al, 2008].

Таким образом, у табака, предварительно обработанного ионами меди, в сравнении с контрольными растениями, в пост-стрессовый период наблюдали увеличение содержания пероксида водорода и ТБК-РП, являющихся маркерами стресса, что указывает на неполную реабилитацию растений. При этом рост надземных органов был подавлен значительно меньше, чем корня.

Заключение

Были определены реакции разных органов растений N. tabacum в период последействия 100 и 300 мкМ Cu2+. Установлено, что растения N. taba-cum чувствительны к этим концентрациям Cu2+, и в период после снятия действия стрессора растут хуже, чем растения, не подвергавшиеся стрессу. Уровень ПОЛ и содержание пероксида водорода были выше в предварительно стрессированных растениях. Одной из реакций растений на последействие избытка ионов меди в среде явилось увеличение активности ГПО в корне. Однако активность СОД во всех органах растения уменьшалась. При этом снижения количества стрессовых маркеров (пероксид водорода и ТБК-РП) не происходило. Органом, испытывающим наиболее сильное последействие Cu2+, являлся корень. Его вероятная барьерная роль ограничивала транспорт ионов меди в побег и обеспечивала менее существенное торможение роста этих органов. Таким образом, в 20-дневный период последействия ионов меди рас- тения табака восстанавливали рост, однако не достигали показателей контрольных растений.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 02.A03.21.0006).