Воздействие импульсного магнитного поля высокой напряженности на дермальные фибробласты человека в культуре

дермальные фибробласты, морфология клеток.

полей в лечебной практике. В настоящее время широко применяются постоянные, переменные и импульсные магнитные поля (ПМП, ПеМП и ИМП) с невысокими значениями магнитной индукции (до 100 мТл) [1-5]. По мнению большинства авторов [6-10], в основе биологического и лечебного действия магнитных полей лежат изменения в состоянии клеточных мембран, ферментативных и рецепторных молекул, повышением проницаемости плазмо-леммы клеток.

Магнитные поля широко применяются в технике, но их параметры значительно отличаются от используемых в медицине. В последнее время на машиностроительных предприятиях внедрены процессы магнитноимпульсной штамповки, сборки, сварки [11]. Источником импульсных магнитных полей (ИМП) в этих процессах является индуктор [12], соединённый с магнитно-импульсной установкой (МИУ) [13]. В процессе разряда батареи конденсаторов МИУ на индуктор, в образованной таким образом разрядной цепи, протекает ток, характер изменения которого показан на рисунке 1.

Из приведенных осциллограмм видно, что характер протекающего тока зависит от сопротивления разрядной цепи: периодический разряд – затухающая синусоида или апериодический разряд.

Рис. 1. Осциллограмма разрядного тока при использовании: (а) – одновиткового индуктора (б) – многовиткового индуктора

Интенсивность магнитного поля зависит от количества энергии W =

CU² ~~2~,

запасённой в

батарее конденсаторов магнитно-импульсной установки, которая для используемых индукторов определяет уровень напряженности. В таблице 1 представлены значения параметров ИМП наиболее часто используемых в технике.

Видно, что параметры ИМП получаемых в технике, при токах в разрядной цепи 10-100 кА, на порядки отличаются от значений, которые используются в цитируемых выше медицинских работах.

Целью данного исследования является изучение воздействия импульсного магнитного поля высокой напряженности на культуру дермальных фибробластов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Техническая составляющая. На рисунке 2 представлены схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дермальных фибробластов человека. С помощью датчиков Холла получены картины распределения магнитного поля « H » в двух координатах. Параметры используемой магнитно-импульсной установки приведены в таблице 2.

На рисунке 3 представлен внешний вид индукторов.

Эксперименты проводились при W = 500 Дж и 1000 Дж. Осциллограммы напряженности магнитного поля при W = 1000 Дж представлены на рисунке 4. Частотные характеристики индуктора с замкнутым контуром и плоского индуктора составляют 18,9 кГц и 19,7 кГц соответственно, что находится в одном диапазоне частот.

Биологическая составляющая. Научное исследование воздействия магнитно-импульсной установки «МИУ-Био» было проведено на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа.

Забор первичного материала (биоптатов кожи) для выращивания культуры фибробластов производили у соматически здоровых и обследованных доноров после получения добровольного информированного согласия и одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ. Фибробласты выращивали по методике первичных эксплантатов (К.Н. Гринберг и соавт., 1988) [14].

Для проведения эксперимента фибробласты снимали со дна культурального флакона стандартным методом и высевали в культуральные чашки Петри диаметром 3,5 см в дозе 1х104 кл./ см2. Культивирование проводили в условиях СО2-инкубатора (Sanyo – Incubator, MCO-18AС, Япония) при температуре 37°С, 5% СО2 и постоянной влажности в полной ростовой среде (среда 199 – 90%, эмбриональная телячья сыворотка – 10% (ООО «БиолоТ», РФ), гентамицин – 40 мкг/мл). Количество чашек - 40. По достижению клетками конфлуентного монослоя чашки были разделены следующим образом: 2 опытные серии (в каждой по 16 чашек) и 2 контрольные серии (в каждой по 4 чашки, на которые не было оказано воздействие магнитным полем); опытные серии делили на 2 подгруппы соответствен-

Таблица 1. Параметры импульсных магнитных полей, используемые в технике

H, А/м	f . кГц	t , c
(0,2- 10,0) ■ 106	10-100	10-4-10-5

a)

Вектор магнитного поля - Игл (направлен вертикально)

Рис. 2. Схемы воздействия ИМП на клеточную культуры дермальных фибробластов (а – индуктор с замкнутым контуром, б – плоский индуктор)

б)

но энергии облучения. В 1 серии воздействие магнитным полем оказывали в продольном направлении, во 2 серии – в поперечном. Опытные чашки подвергали однократному облучению магнитно-импульсным полем при энергиях 500 Дж и 1000 Дж. Длительность наблюдения составляла 48 часов после воздействия ИМП ВН.

Проводили наблюдение за состоянием клеток в монослое и фотографирование их при помощи аппаратно-программного комплекса (АПК), состоящего из инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры Olympus SC100 («Olympus», Корея) и стационарного компьюте-

Таблица 2. Параметры магнитно-импульсной установки «МИУ-Био»

Запасаемая энергия W, кДж	Напряжение разряда U, кВ	Собственная частота разрядного тока f, кГц	С о , мкф	L o , мкГн
1	1 – 5	60	82	0,09

Индуктор с замкнутым контуром

Плоский индуктор

Рис. 3. Внешний вид индукторов с размещенной чашкой Петри

б)

Рис. 4. Осциллограммы напряженности магнитного поля (а – индуктор с замкнутым контуром, б – плоский индуктор)

ра. Для обработки изображений использовали программное обеспечение CellSens Standart 1.7 («Olympus Corporation», Япония). Непосредственно перед началом воздействия, а затем в конце эксперимента монослой окрашивали суданом IV и гематоксилином для общеморфологического анализа и витальными красителями для выявления жизнеспособных и поврежденных клеток (трипановый синий и флуоресцентный набор LIVE/DEAD ® (Invitrogen, США)). Ана- лиз изображений окрашенных препаратов производили с помощью системы визуализации на основе исследовательского люминесцентного микроскопа Leica DMIL LED (Германия) с флуоресцентным блоком.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При осмотре контрольных чашек: монослой равномерный, характер роста в виде завит- ков (рис. 5а). Клетки близко расположены друг к другу, имеют 2-3 отростка. Форма клеток веретенообразная, контуры четкие, цитоплазма гомогенная, слабо оксифильная. Ядра расположены в основном эксцентрично, содержат 2-3 ядрышка (рис. 5а), выявлены делящиеся клетки (рис. 5б). При окрашивании клеток витальным красителем трипановым синим все клетки прозрачные (жизнеспособные), окрашенных в синий цвет (поврежденных) не выявлено (рис. 5в). При обработке монослоя флуоресцентным набором LIVE/DEAD ® клетки приобрели зеленое свечение, что подтверждает их жизнеспособность; клетки со светящимся красным ядром единичные (рис. 5г).

Серия 1а. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 3,76·106 А/м (500 Дж)

При однократном воздействии магнитным полем в продольном направлении с энергией 500 Дж через 48 часа отмечено, что клетки изменили свое расположение на дне культурального пластика в результате воздействия силовых линий магнитного поля (рис 6а). Клетки сохранили свои характерные морфологические особенности, но стали более вытянутыми. Контуры клеток четкие, цитоплазма гомогенная (рис. 6 б).

Соотношение жизнеспособных и поврежденных клеток соответствовало таковому в контрольной культуре (рис. 6в, 6г).

Серия 1б. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 4,42·106 А/м (1000 Дж.)

При продольном воздействии ИМП ВН с энергией 1000 Дж через 48 часов на дне чашки зафиксировано смещение клеток в монослое по ходу воздействия магнитного поля (рис. 7а), в клетках при обзорной окраске суданом IV и гематоксилином выявлены поврежденные клетки с разрушенными ядрами (кариопикноз, карио-рексис) (рис.7б). При окраске монослоя трипановым синим, были обнаружены поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис.7в). При обработке монослоя флуорофорами отмечали большое количество ядер с красной люминесценцией, что свидетельствовало об их повреждении (рис. 7г).

Серия 2а. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 7,1·106 А/м (500 Дж)

При поперечном воздействии при 500 Дж через 48 часов при осмотре клеток в монослое наблюдали изменение характера роста клеток с изменением геометрического рисунка (рис.8а). При обзорных окрасках отметили, что клетки п стали более вытянутыми, отростки были длиннее, чем в контрольной серии. В некоторых клетках наблюдали зернистость цитоплазмы и просветление вокруг ядер (рис.8б). При окраске

a

б

Рис. 5. Контроль. Культура дермальных фибробластов. Сформированный равномерный монослой через 48 часов после посева. Окраска суданом IV и гематоксилином: а – характер роста фибробластов в монослое. Увеличение 100, б – делящаяся клетка отмечена стрелкой, увеличение 400;

в – жизнеспособные клетки в монослое. Окраска трипановым синим . Увеличение 100. Инвертированный микроскоп; г - флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD^®. Люминесцентный микроскоп увеличение 100

a

a

Рис. 6. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после продольного воздействия ИМП ВН с энергией 500 Дж. Окраска суданом IV и гематоксилином: а – выстраивание клеток под воздействием магнитных силовых линий, увеличение 100;

б – морфологическая картина клеток после воздействия, увеличение 400;

в – окраска трипановым синим, инвертированный микроскоп увеличение 100;

г – флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD®. Люминесцентный микроскоп. увеличение 100

Рис. 7. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после продольного воздействия ИМП ВН с энергией 1000 Дж: Окраска суданом IV и гематоксилином:

а – смещение клеток в монослое под воздействием силовых линий, увеличение 100;

б - морфологические изменения клеток, увеличение 400;

в – окраска трипановым синим (поврежденные клетки отмечены стрелками). Инвертированный микроскоп увеличение 100;

г – флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD ® (поврежденные клетки отмечены стрелками). Люминесцентный микроскоп, увеличение 100

трипановым синим выявляли поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис. 8в). Обработка монослоя флуоресцентным красителем позволила обнаружить выявить погибшие клетки с красной люминесценцией ядер (рис. 8г).

Серия 2б. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 8,7·106 А/м (1000 Дж)

При воздействии ИМП ВН энергией 1000 Дж в поперечном направлении в момент облучения крышка чашки Петри лопнула. Через 48 часов при окраске монослоя суданом IV и гематоксилином были обнаружены коагуляционные участки в виде темных клубков с хаотично расположенными клетками, границы которых не визуализировались (рис. 9а). Большинство фибробластов в монослое деформированы, в их цитоплазме наряду с плотными имеются разряженные участки. Контакты между клетками нарушены. Также на поверхности культурального пластика можно видеть фрагменты цито- плазмы, лишенные ядер и обрывки отростков. В клетках ядра деформированы, визуально плотные, структура их не однородная, ядрышки отсутствовали (рис. 9б). Получить изображения клеток с помощью витальных красителей (трипановым синим и набором LIVE/DEAD®) не удалось, так как клетки в результате пробоподго-товки были смыты со дна культуральных чашек, что свидетельствовало об ослаблении адгезии клеток к культуральному пластику под действием данного режима.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках данной работы были спроектированы специализированная магнитно-импульсная установка и измерительный стенд, позволившие получить ИМП с разными параметрами воздействия. Разработаны и опробованы схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дермальных фибробластов с использованием индукторов различных конструкций, для которых была получена топология поля.

а                                      б

б                                           г

Рис. 8. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после поперечного воздействия ИМП ВН с энергией 500 Дж: Окраска суданом IV и гематоксилином:

а – выстраивание клеток в монослое под воздействием силовых линий магнитного поля, увеличение 100; б – морфологические изменения клеток (участки зернистости цитоплазмы отмечены стрелкой), увеличение 400; в – окраска трипановым синим (поврежденные клетки отмечены стрелками).

Инвертированный микроскоп, увеличение 100;

г – флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD® (поврежденные клетки отмечены стрелками).

Люминесцентный микроскоп, увеличение 100

а                                  б

Рис. 9. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после поперечного воздействия ИМП ВН с энергией 1000 Дж:

а – появление коагуляционных участков монослоя (отмечен стрелкой), увеличение 100;

б – морфофункциональные изменения клеток (разрывы цитоплазмы и ядер указаны стрелками), увеличение 400. Окраска суданом IV и гематоксилином.

По результатам экспериментов установлено:

Факт влияния импульсного магнитного поля высокой напряженности на биологический объект, а именно культуру дермальных фибробластов;

Воздействие ИМП ВН в продольном направлении при энергии 500 Дж не вызывает повреждения структуры фибробластов в культуре. Данный режим является безопасным для здоровых первичных культур клеток;

При поперечном воздействии как при 500 , так и при 1000 Дж имеет место повреждение данной популяции клеток вплоть до их гибели;

Намечены пути модернизации магнитноимпульсных установок, с целью управлениями параметрами воздействия ИМП на культуры клеток