Возможность применения МТТ-теста для оценки повреждений микроводоросли при действии ртути и гамма-излучения

Развитие ядерных технологий сопровождается расширением сфер применения ионизирующего излучения в энергетике, медицине и промышленности. Это обусловливает необходимость оценки радиационного воздействия на объекты окружающей среды, в том числе на водные экосистемы, которые могут служить конечным резервуаром для техногенных выбросов. В связи с этим актуально углублённое изучение действия ионизирующего излучения на гидробионтов ‒ ключевых компонентов водных биоценозов. Наряду с радиационным фактором сохраняется острая проблема загрязнения водоёмов химическими поллютантами, одними из которых являются соединения ртути. По данным Росгидромета, фоновое содержание ртути в поверхностных водах РФ в среднем составляет 0,21-0,67 мкг/л [1]. В условиях реальной среды обитания гидробионты редко подвергаются действию какого-либо одного фактора; значительно чаще имеет место комбинированное воздействие, при котором эффект может усиливаться по сравнению с изолированным действием каждого из агентов.

Микроводоросли, в частности представители рода Chlorella , широко используются в биотестировании благодаря высокой чувствительности к внешним стрессорам, быстроте роста и простоте культивирования. Оценка повреждений, вызванных облучением и тяжёлыми металлами, важна для прогнозирования состояния водных экосистем в условиях комплексного антропогенного пресса. Один из перспективных методов – МТТ-тест, основанный на восстановлении

Недодел Д.С.* - инженер; Афонин А.А. - зав. лаб.; Ляпунова Е.Р. - доцент, к.б.н.; Комарова Л.Н. - проф., д.б.н. ОИАТЭ НИЯУ МИФИ.

тетразолиевого красителя митохондриальными дегидрогеназами живых клеток [2]. Этот подход хорошо зарекомендовал себя в медицине и клеточной биологии, однако классические протоколы разработаны для клеток животных и могут быть неприменимы к микроводорослям без адаптации. Основными препятствиями являются плотная клеточная стенка, замедляющая проникновение красителя, высокая активность митохондриальных ферментов у растительных клеток, а также возможное влияние фотосинтетических процессов на результаты колориметрического анализа.

В настоящей работе на примере Chlorella kessleri проведена адаптация МТТ-теста к микроводорослям: варьировались концентрация красителя, время инкубации и длин волн при измерении оптической плотности. На основе подобранных параметров оценена метаболическая активность клеток при раздельном и комбинированном действии ионов ртути (в концентрациях 0,0005 мг/л и 0,005 мг/л) и гамма ‑ излучения (в диапазоне доз 50-150 Гр). Сопоставление полученных данных с литературными результатами для Chlorella vulgaris показало их согласованность, что подтверждает адекватность адаптированного протокола.

Материалы и методы

В качестве объекта была выбрана микроводоросль рода Chlorella – одноклеточная водоросль с характерным для зелёных водорослей соотношением фотосинтетических пигментов, близким к большинству высших растений. Данные водоросли широко используются в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине, сфере производства биотоплива и биологической очистки водоёмов [3-5]. В работе [6] был использован один из видов этого рода микроводорослей Chlorella kessleri , штамм ВКПМ AI-11 ARW. Данный штамм криофильный, он способен сохраняться при температуре 4 ° С и расти при 17 ° С, и планктонный, т.е. в толще воды клетки находятся во взвешенном состоянии. Также штамм обладает способностью предотвращать избыточный рост цианобактерий [7]. Он утверждён для коррекции альгоценоза водоёмов, в том числе и водоёмов-охладителей АЭС, с целью их реабилитации [8].

Культивирование микроводоросли проводили с использованием 30% жидкой культуральной среды Тамия со следующим составом: KNO 3 - 5,0 г/л, MgSO 4 x 7H 2 O - 2,5 г/л, KH 2 PO 4 - 1,25 г/л, FeSO 4 – 0,003 г/л. Эта среда представляет питательный раствор высокой концентрации минеральных солей, содержащий большое количество меди, марганца и молибдена, благотворно влияющих на рост водоросли. Такая питательная среда хорошо подходит для культивирования микроводоросли в лабораторных условиях, т.к. обеспечивает быстрый рост культуры хлореллы [9]. Оптимальной температурой для выращивания криофильного штамма Chlorella kessleri является 25-30 ° С. Культивирование водоросли производилось в специально разработанном в КрасГУ культиваторе КВ-05 при температуре 25 ° С. Культура водоросли эффективно снабжается углекислым газом благодаря постоянному вращению ёмкости вдоль своей оси, необходимый уровень освещения поддерживается лампой накаливания мощностью 15 Вт [10].

Для моделирования условий химического загрязнения культуру клеток Chlorella kessleri культивировали в течение суток с раствором нитрата ртути (II). Были использованы концентрации дозы токсиканта в 0,5 и 5,0 мкг/л, что соответствует 1 и 10 ПДК для воды [11].

Для моделирования радиационного воздействия культуру клеток Chlorella kessleri облучали на уникальной научной установке «ГУР-120» [12] с источником излучения ⁶⁰Со (НИЦ «Курчатовский институт» – ВНИИРАЭ) дозами 50, 100 и 150 Гр при мощности дозы 58 Гр/ч.

В качестве метода измерения жизнеспособности клеток был выбран МТТ-тест (колориметрический анализ). Данный метод широко используется как скрининговый метод измерения выживаемости клеток и включён в большинство протоколов методов молекулярной биологии и медицины [2, 13]. Его суть заключается в цветной реакции солей тетразолия (МТТ) в присутствии метаболически активных клеток. Эта способность к восстановлению жёлтого реагента МТТ обеспечивается NAD(P)H-зависимыми клеточными оксидоредуктазами, которые участвуют в процессах окислительного фосфорилирования в митохондриях клетки. Митохондриальная активность напрямую связана с метаболической активностью клетки, т.к. эти органеллы ответственны за окисление субстратов (пирувата и жирных кислот), цикл трикарбоновых кислот, функционирование дыхательных цепей и сопряжение окисления и фосфорилирования. В основе методики МТТ-теста лежит реакция восстановления жёлтой соли тетразолия (МТТ) митохондриальными дегидрогеназами, обычно оксигеназами, живых клеток до кристаллов формазана фиолетово-пурпурного цвета, которые нерастворимы в водной среде. Получившиеся кристаллы формазана (МТТ-ф) для проведения колориметрического анализа растворяют в ДМСО или в смеси HCl-изопропанол, чтобы вновь перевести соединение в растворимую форму и измерить на специальных приборах оптическую плотность [10].

Для получения результатов эффективности метаболической активности измеряют оптическую плотность контрольных, опытных и фоновых образцов на фотометрическом приборе и рассчитывают результаты по формуле (1):

МА = ( 1 - О О Оп Ф. ) ^{х 100} % , (1)

где ОП О – оптическая плотность в исследуемом образце; ОП Ф – средняя оптическая плотность фоновых проб; ОП К – оптическая плотность в контроле [2, 7].

Такой расчёт довольно прост и использует отношение пика поглощения формазана экспериментального и контрольного образцов. Измерения могут проводиться в широком диапазоне длин волн, что позволяет использовать метод МТТ-теста в лабораториях с различным техническим оснащением. Пик поглощения формазана занимает место от 400 до 700 нм, однако в большинстве методик используются длины волны 450, 492 и 530 нм, стандартные на многих спектрофотометрических приборах [14]. Исходя из этих данных оптическую плотность образцов измеряли на тех же длинах волн: 450, 492, 530 нм.

При проведении МТТ-теста выделяют клеточную культуру микроводоросли Chlorella kessleri , добавляют 100 мкл МТТ-красителя и инкубируют. После центрифугирования удаляют супернатанат и добавляют 100 мкл ДМСО. Содержимое пробирок встряхивают на вортексе для растворения гранул формазана, затем вновь центрифугируют и полученную надосадочную жидкость переносят в лунки 96-луночного планшета по 200 мкл на каждую лунку.

Для измерения оптической плотности образцов использовали 2 иммуноферментных анализатора (ИФА): “Stat Fax 2100” и “Multiskan FC”. На ИФА “Stat Fax 2100” производили измерение в режиме спектрофотометра на рабочей длине волны 492 нм и шумовой 630 нм. На ИФА “Multiskan FC” производили измерения 2 типов: 450 нм рабочая длина волны и 620 нм шумовая; 530 нм рабочая и 620 нм шумовая. В данном исследовании значимость отличия с контролем и другими группами количественных признаков оценивалась с помощью теста Манна-Уитни, расчёты проведены в программе Statistica 12.

Результаты и обсуждение

В классических методиках МТТ-теста на отдельных клетках используется концентрация тетразолиевого красителя 5,0 мг/л, однако в ходе исследования установлены неоднозначные результаты при использовании красителя такой концентрации на клетках микроводоросли. В других исследованиях на водорослях применялись концентрации красителя на порядок меньше классической [15], поэтому было принято решение исследовать 2 концентрации МТТ-красителя – 5,0 и 0,5 мг/л. По результатам исследования построены графики зависимости метаболической активности от действия ртути и гамма-излучения (рис. 1).

А

Рис. 1. Зависимость метаболической активности у Chlorella kessleri от комбинированного действия гамма-излучения и ртути (концентрация 1 ПДК (0,0005 мг/л)), полученная при использовании МТТ-красителя в концентрации 0,5 мг/л (А) и в концентрации 5,0 мг/л (Б). * р<0,050 – тест Манна-Уитни.

Б

Из рис. 1А видно, что все опытные данные отличаются от контрольных. На рис. 1Б только одно значение, полученное при дозе облучения 150 Гр и концентрации ртути 1 ПДК, обладает статистической значимостью. Наблюдаемый сдвиг значений метаболической активности выше 100% указывает на артефакт измерения, а не на стимуляцию метаболизма. Это может объясняться избыточным образованием формазана при использовании МТТ-красителя в концентрации 5 мг/л на клетках микроводоросли. Концентрация МТТ-красителя в 0,5 мг/л была выбрана основной, т.к. в этом случае были получены удовлетворительные результаты.

Ещё одной адаптацией МТТ-теста было изменение времени инкубации МТТ-красителя. В классическом МТТ-тесте время инкубации после добавления МТТ-красителя обычно составляет от 1 до 4 ч [2]. Для растительных клеток, характеризующихся более высокой активностью митохондриальных ферментов, этот интервал может быть избыточным и приводить к неспецифическому окрашиванию [16]. В предыдущем исследовании на Chlorella было показано, что инкубация в течение 1,5 ч обеспечивает стабильные и воспроизводимые результаты [17], поэтому данный временной интервал был выбран для дальнейших экспериментов.

Из рис. 2А видно, что все экспериментальные данные отличаются от контрольных. На рис. 2Б также наблюдается статистически значимые отличия, но наблюдаемый сдвиг значений метаболической активности выше 100% указывает на артефакт измерения. Длительная инкубация клеток микроводоросли с МТТ-красителем может приводить к неспецифическому окрашиванию и лизису клеток при высоких дозах облучения.

А

Б

Рис. 2. Зависимость метаболической активности у Chlorella kessleri от комбинированного действия гамма-излучения и ртути (концентрация 1 ПДК (0,0005 мг/л)), полученная при инкубировании с МТТ-красителем в концентрации 0,5 мг/л в течение 1,5 ч (А) и в течение 4 ч (Б). * р<0,050 – тест Манна-Уитни.

По результатам анализа полученных данных метаболической активности микроводоросли Chlorella kessleri при комбинированном действии ртути и гамма-излучения, измеренных на исследуемых длинах волн, построили графики зависимости метаболической активности от дозы гамма-излучения в комбинации с ртутью в концентрации 1 ПДК (0,0005 мг/л) (рис. 3).

Из рис. 3А видно, что все опытные данные достоверно отличаются от контрольных. При концентрации ртути 1 ПДК метаболическая активность клеток микроводоросли Chlorella kessleri понижается с увеличением дозы гамма-излучения до 150 Гр.

В

Рис. 3. Зависимость метаболической активности у Chlorella kessleri от комбинированного действия гамма-излучения и ртути (концентрация 1 ПДК (0,0005 мг/л)), измеренная на рабочей длине волны 450 нм и шумовой 620 нм (А), рабочей длине волны 492 нм и шумовой 630 нм (Б), рабочей длине волны 530 нм и шумовой 620 нм (В). * р<0,050 – тест Манна-Уитни.

Представленные результаты на рис. 3Б и 3В иллюстрируют схожую зависимость с предыдущим измерением на рабочей длине волны 450 нм, но следует отметить, что изменения метаболической активности (рис. 3Б), полученные при комбинированном действии ртути в концентрации 1 ПДК и облучения гамма-квантами в дозах 50 и 100 Гр, статистически не отличаются от контроля, а проведение измерений при длине волны 530 нм (рис. 3В) приводит к повышению метаболической активности, что может свидетельствовать об артефакте при измерении.

Полученные зависимости метаболической активности Chlorella kessleri при комбинированном действии ртути 1 ПДК (0,0005 мг/л) и гамма ‑ излучения сопоставлены с литературными данными по снижению числа микроколоний Chlorella vulgaris в аналогичных условиях [18]. Штамм Chlorella kessleri ВКПМ AI-11 ARW, используемый в данном исследовании, был получен в ходе селекции микроводорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG и Chlorella vulgaris BIN, поэтому предполагается, что Chlorella kessleri аналогично реагирует на ионизирующее излучение и воздействие ионов ртути [5]. Выращивание Chlorella kessleri на той же питательной среде Тамия, что и Chlorella vulgaris, позволяет сравнивать результаты без учёта влияния различий в составе питательных сред [9]. Наибольшее соответствие между рядами данных наблюдали при проведении измерений на рабочей длине волны 450 нм, шумовой 630 нм (рис. 3А).

Исследование комбинированного влияния ртути и гамма-излучения при концентрации ртути 10 ПДК проводили тем же образом. Результаты анализа полученных данных изменения метаболической активности микроводоросли Chlorella kessleri при комбинированном действии раствора ртути в концентрации 10 ПДК и гамма-излучения приведены на рис. 4.

В

Рис. 4. Зависимость метаболической активности у Chlorella kessleri от комбинированного действия гамма-излучения и ртути (концентрация 10 ПДК (0,005 мг/л)), измеренная на рабочей длине волны 450 нм и шумовой 620 нм (А), рабочей длине волны 492 нм и шумовой 630 нм (Б), рабочей длине волны 530 нм и шумовой 620 нм (В). * р<0,050 – тест Манна-Уитни.

Полученные результаты (рис. 4А) демонстрируют статистически значимое падение уровня метаболической активности при повышении дозы гамма-излучения. Все полученные данные достоверно отличаются от контроля. При высокой концентрации ртути 10 ПДК происходит радиосенсибилизация клеток микроводоросли Chlorella kessleri , что приводит к выраженному токсическому действию. Данные, полученные на длинах волн 492/630 (рис. 4Б), также иллюстрируют умеренный спад метаболической активности клеток микроводоросли, однако статистически значимым значением можно считать лишь значение при дозе 150 Гр. Результаты измерения на длинах волн 530/620 (рис. 4В) иллюстрируют лишь небольшое снижение метаболической активности клеток микроводоросли. Полученные значения не имеют статистической значимости, что означает отсутствие достоверности у данной зависимости.

Нами так же проведено сопоставление результатов, полученных при комбинированном действии ртути в концентрации 10 ПДК (0,005 мг/л) и гамма-излучения, с литературными данными [18]. Как и в предыдущем случае, наилучшее совпадение выявлено для спектрофотометрических измерений при рабочей длине волны 450 нм, шумовой 630 нм (рис. 4А).

Заключение

В работе оптимизирована и модифицирована методика проведения МТТ-теста для оценки метаболической активности клеток микроводоросли на примере Chlorella kessleri . Проанализированы данные измерений МТТ-теста на спектрофотометре при разных длинах волн, выбраны оптимальные параметры для регистрации изменений метаболической активности Chlorella kessleri при комбинированном действии ионов ртути и гамма-излучения, при которых получены достоверные и статистически значимые результаты. Полученные данные свидетельствуют о том, что проведение МТТ-теста на микроводорослях целесообразно при использовании следующих модификаций: 1) использование МТТ-красителя в концентрации 0,5 мг/л; 2) инкубация клеток микроводоросли с МТТ-красителем в течение 1,5 ч; 3) измерение оптической плотности образцов при рабочей длине волны 450 нм и шумовой 630 нм.