Возможность сохранения некоторых групп микроорганизмов в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida andrei Bouche)

Таким образом, показано, что среди культивируемых видов, выделенных из щелочных гидротерм Бурятии и Монголии, преобладают как широко распространенные термофильные алка-лотолерантные бациллы, так и новые виды аэробных и факультативно-анаэробных алкалото-лерантных умеренно термофильных бактерий, способных использовать широкий спектр органических субстратов.

Работа была выполнена при финансовой поддержке проекта молодых ученых СО РАН «Разнообразие и функционирование микробного сообщества в щелочных водных экосистемах Забайкалья» и интеграционного проекта СО РАН №24.

О.Ф. Вятчина, Д. И. Стом, О.С Рыкова, В. А. Быбин, А.В. Кононова г. Иркутск

Возможность сохранения некоторых групп микроорганизмов в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Войске)*

The ability of different groups of microorganisms to survive and keep itself in intestines of Red Californian hybrid (Eis-enia fetida Andrei Bouche) is investigated. It is shown, that oil-destroing strain of Yarrowia lipolytica is capable to keep itself in intestines of earthworm during 8 days, and Rhodococcus erythropolis only within a day. Bacillus thuringiensis collects in intestines of earthworms, becomes a dominating component of bacterial auto flora, keeps toxin formation ability; don "t bring harm to an animal It is revealed, that Streptomyces sp. spores keep ability to germinate after passage through the intestinal puth of a worm. Staphylococcus sp. strain is capable to reserve itself in intestines of a worm untill 2 months.

Исследована способность микроорганизмов разных групп выживать и сохраняться в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche). Показано, что нефтеразрушающий штамм Yarrowia lipolytica способен сохраняться в кишечнике червя в течение 8

суток, a Rhodococcus erythropolis только в течение суток. Bacillus thuringiensis накапливается в кишечнике дождевых червей, становится доминирующим компонентом бактериальной аутофлоры, сохраняет способность к токсинообразованию, не принося вреда животному. Выявлено, что споры Streptomyces sp. сохраняют способность к прорастанию после пассажа через кишечный тракт червя. Штамм Staphylococcus sp. способен резервироваться в кишечнике червя до 2 месяцев.

Изучение взаимосвязей между микроорганизмами и беспозвоночными животными, обитающими в почве, является важным направлением почвенно-биологических исследований [6], Деструкция отмирающей биомассы растительного и животного происхождения осуществляется в почве благодаря сбалансированной деятельности сапротрофного зоомикробного комплекса. При всей очевидности того, что роль микробного фактора в сапротрофном зоомикробном комплексе велика, функции конкретных микроорганизмов и механизмы их взаимодействия с организмом животного изучены недостаточно [2, 3, 4]. Большое значение в процессах трансформации органического вещества принадлежит дождевым червям. Эти животные поглощают значительное количество опада и вовлекают его в почву [2]. Прямое взаимодействие микроорганизмов с беспозвоночными возможно при потреблении последними пищи, населенной микробами, в пищеварительном тракте и экскрементах животного [6].

Целью настоящей работы явилось изучение способности микроорганизмов накапливаться в кишечнике дождевых червей и оставаться жизнеспособными после пассажа через кишечник.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили особи красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche). Для пассажа через организм червей использовали штаммы, входящие в состав нефтеразрушающего препарата деворойл: Rhodococcus erythropolis, Yarrowia lipolytica (культуры представлены И.А. Борзенковым). Также для исследования были взяты энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis ssp. alesti [4], штамм Streptomyces sp., выделенный из почвы и Staphylococcus sp.

Для микробиологических исследований брали червей, которых предварительно выдерживали голодными в течение двух суток в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой. Для инокуляции червей применяли различные методы. Пероральное введение суспензии (0,03 мл) проводили при помощи стерильного инсулинового шприца. При использовании метода свободного скармливания червей подсаживали в чашки Петри со стерильной целлюлозой, обработанной 1 мл суспензии соответствующей культуры. Целлюлоза использовалась как носитель микроорганизмов [3]. Инокуляцию червей Streptomyces sp. проводили двумя способами: per os и контактным способом. В течение опыта особей содержали в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой без внесения корма. На I-е, 4-е, 5-е, 7-е, 8-е, 10-е, 30-е и 60-е сутки опыта производили асептическое вскрытие червей.

Для выделения нефтеразрушающих штаммов R. erythropolis и Y. lipolytica отпрепарированную ткань эпителия переднего, среднего и заднего отделов кишечника вместе с содержимым помещали в стерильную ступку и растирали с 1 мл физиологического раствора, содержащего твин-20. Использовали 1%-ный и 0,1%-ный растворы твина-20. Затем объем гомогената доводили до 5 мл. Посев производили из исходного разведения на питательную среду следующего состава (%): KNO3 - 0,40; MgSO₄ - 0,08; КН>РО₄ - 0,06; Na_?HPO₄ -0,14; гексадекан - 1; агар-агар - 2; pH 7,2-7,3.

Для изоляции энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis содержимое кишечника высевали на РПА, для селективного выделения штамма Staphylococcus sp. - на РПА с 5% NaCl.

Для выделения стрептомицета использовали среду Гаузе №1 следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20,0; KNOj - 1,0; К2НРО4 - 0,5; MgSO4x7 Н2О - 0,5; NaCl - 0,5; FeSO4x7 Н2О - следы; агар-агар - 20; pH 7,2-7,4.

Микробиологическому анализу подвергали копролиты червей, выброшенные животными на соответствующие сутки опыта. Параллельно осуществляли вскрытие голодных червей, не подвергавшихся инокулированию, содержащихся в стерильных чашках Петри.

Для определения количества жизнеспособных клеток (спор) в исследуемых субстратах использовали метод серийных разведений с последующим высевом на соответствующие элективные среды [5]. Посевы инкубировали при температуре 28-30°С.

Результаты и обсуждение

Использование методики количественного учета микроорганизмов после обычно применяемой подготовки образца не позволило изолировать из кишечника красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouehe) нефтеразрушающие штаммы, что, вероятно, связано с высокой степенью адгезии клеток этих бактерий к кишечному эпителию. В связи с этим была применена механическая обработка анализируемого материала (5-мин. растирание в ступке) с использованием 1%- и 0,1%-ного раствора твина-20. Оптимальным для выделения исследуемых культур оказалось применение 1%-ного раствора твина-20.

Полученные данные свидетельствуют о том, что кишечник червя является неблагоприятной средой для нефтеразрушающего штамма R. erythropolis. При пероральном введении 0,03 мл односуточной суспензии Л. erythropolis штамм был обнаружен только на 1-е сутки опыта. Титр культуры составил в переднем отделе кишечника - 2,15±0,39х 10⁵, в среднем - 8,38+0,75x1 О⁴, в заднем - 4,96±0,14х]0⁴КОЕ/г (табл. 1). Тенденция уменьшения количества клеток R. erythropolis от переднего к заднему отделу кишечника червя, вероятно, связана с их частичным перевариванием. Следует отметить, что для штамма R. erythropolis, прошедшего пассаж через кишечный тракт червя, характерна низкая скорость роста на элективной среде. Для культивирования необходимо от 32 до 36 суток. В ходе опыта выявлены некоторые специфические особенности взаимодействия R. erythropolis и дождевых червей. После инокуляции черви выделяли защитную жидкость желтого цвета.

Таблица 1 Динамика численности клеток Rhodococcus erythropolis в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника	Титр, КОЕ/г
	1 -е сутки	5-сутки	8-е cyi ки
Передний	2,15+0,39x105	-	-
Средний	8,38+0,75x10"	-	-
Задний	4,96+0,14x10"	-

Нефтеразрушающие дрожжи К lipolytica сохранялись в кишечнике червя более длительное время - в течение 8-ми суток. На 1-е сутки опыта титр культуры составил в переднем отделе кишечника 1,41 ±0,24x10⁵, в среднем - 1,28±0,23х10⁴, в заднем - 3,84+0,73x10⁴ КОЕ/г. На 5-е сутки инкубации червей Y. lipolytica была выделена только из переднего отдела кишечника, на 8-е - из переднего и заднего отделов кишечника (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, дрожжи частично утилизируются червями, в то же время после периода некоторой адаптации начинается их размножение, что выражается в увеличении тигров культуры на 8-е сутки опыта (табл. 2). Следует отметить, что при выделении штамма К lipolytica из кишечника червя время инкубации составило 28 суток.

Таблица 2

Динамика численности клеток Yarrowia lipolytica в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника	г                    Титр, КОЕ/г
	1 -е сутки	5-е сутки	8-е сутки
Передний	1,41+0.24x10’	7,26+0,87x10"	8,41+0,93x10"
Средний	1,28+0,23x10"	•	-
Задний	3,84+0,73x10"	•	9,83+0,79x10"

В. thuringiensis сохранялся в кишечнике красного калифорнийского гибрида на протяжении 60-ти суток опыта. На первые сутки инкубации червей жизнеспособные споры культуры были обнаружены в переднем и среднем отделах кишечника. Титр составил 8,97+0,72x10⁴ и 3,80±0,65хЮ^? КОЕ/г, соответственно. На 8-е сутки В. thuringiensis был обнаружен во всех отделах кишечника червя (табл. 3). На 20-е сутки содержания животных из переднего отдела В. thuringiensis не был изолирован, в среднем и заднем отделах кишечника отмечалось значительное увеличение титра исследуемого штамма (табл. 3). К 60-м суткам опыта произошло снижение количества жизнеспособных спор В. thuringiensis в среднем отделе до 8,5 0+0,68x10³, а в заднем - до 4,20±0,63 - Ю² КОЕ/г (табл. 3).

Динамика численности клеток штамма Bacillus thuringiensis ssp. alesti 6-12 кс в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника	Титр. КОЕ/г
	1 -е сутки	8-е сутки	20-е сутки	60-е сутки
Передний	8,97±0,72хЮ4	8,54+0,73x10’'	-
Средний	3,80+0,65x10’	1,ЗО±О,18хЮ3	8,5010,76x10’	8,50±0,68><102
Задний	-	1.280,23±х104	7,69+0,62хЮ4	4,20+0,63х!02.

Следует отметить, что штамм В. thuringiensis ssp. alesti 6-12 кс после пассажа через кишечный тракт червя сохранил способность к токсинообразованию,

Streptomyces sp., инокулированный в организм червя контактным способом, сохранялся в кишечном тракте красного калифорнийского гибрида в течение 4-х суток. При этом титр жизнеспособных спор исследуемого штамма стрептомицета снижался в кишечном тракте червей ст переднего к заднему отделу. Так, количество жизнеспособных спор Streptomyces sp. в переднем отделе кишечника на 1-е сутки инкубации животных составило 8,40+0,76x10³, на 4-е -2,72±0,46хЮ⁴, в среднем на 1-е - 1,80+0,31х10³, на 4-е - 7,ОО±О,58х]О³ КОЕ/г. В заднем отделе кишечника титр составил на 1-е сутки опыта 0,8+0,14х 10³ КОЕ/мл. При высеве содержимого заднего отдела кишечника на 4-е сутки были выделены единичные колонии, что не позволило определить титр стрептомицета. На 8-е сутки инкубации червей исследуемый штамм Streptomyces sp. не был выделен.

Во втором варианте опыта червям перорально вводили 0,03 мл водной суспензии Streptomyces sp. с титром 1,2+0,19^х! О⁴ КОЕ/мл. На 1-е сутки опыта титр культуры составил в переднем отделе кишечника 1,40±0,25^хЮ⁴, в среднем - 1,5О±О,27хЮ³, в заднем -1,ЗО±О,26хЮ³ КОЕ/г. При высеве содержимого кишечника на 4-е и 7-е сутки, а также при высеве копролитов червей выросли единичные точечные колонии исследуемого штамма стрептомицета.

Уменьшение количества жизнеспособных спор Streptomyces sp. от переднего отдела кишечника к заднему связано с их частичным перевариванием. Полученные нами данные согласуются с исследованиями Л.М, Полянской, Н.И. Бабкиной и др. по изучению «поведения» актино-мицетов в кишечном тракте дождевых червей и кивсяков при поедании животными стрептоми-цетных спор [7].

Следует отметить, что в переднем отделе кишечника преобладали колонии основного типа: округлые, с белым хорошо развитым воздушным мицелием (ВМ) и с синим субстратным мицелием (СМ). При высеве содержимого среднего и заднего отделов кишечника наблюдалась диссоциация культуры стрептомицета. Это выражалось в таких морфологических характеристиках колонии, как цвет ВМ, интенсивность и распределение пигмента по поверхности колонии. По-видимому, в среднем и заднем отделах кишечника стрептомицеты испытывают наибольший стресс, что увеличивает их изменчивость.

Staphylococcus sp. отличался от других исследуемых штаммов спосбностью к длительному существованию в кишечнике Eisenia felida Andrei Bouche при достаточно высоких титрах. После введения в кишечник червей 0,03 мл суспензии односуточной культуры с титром 4,95±0,89х 10⁸ КОЕ/мл выявлена следующая динамика численности клеток Staphylococcus sp. в переднем, среднем, заднем отделах кишечника и в копролитах. На 1-е сутки после инокуляции червей из содержимого переднего и среднего отделов кишечника Staphylococcus sp. не был выделен, что, по-видимому, связано с частичным перевариванием клеток исследуемого штамма. Однако часть клеток Staphylococcus sp. сохраняется и размножается, о чем свидетельствует титр жизнеспособных клеток в заднем отделе кишечника, составляющий 1,50±0,29х10⁸ КОЕ/г. В копролитах титр Staphylococcus sp. был достаточно высоким и составил 2,00±0,36х10⁵ КОЕ/г (табл. 4).

К 7 суткам опыта исследуемый штамм был обнаружен во всех отделах кишечника (табл. 4). В заднем отделе кишечника численность клеток Staphylococcus sp. увеличилась до 6,67±0,93хЮ⁹ КОЕ/г. В копролитах, выброшенных червем на 7-е сутки, исследуемый штамм не был обнаружен.

Динамика численности клеток Staphylococcus sp. в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Сутки	.       Тzip Staphylococcus sp., КОЕК
	передний отдел кишечника	средний отдел кишечника	задний отдел кишечника	Колролиты
1			1,50+0,29x10®	2,00+0.36x10’
7	3,33±О,57х1О10	1,00+0,14x10’	6.67+0,93x109	-
10	2,33+0,42x10’	2,67+0,51x10”	1,33+0,24x10’	1,00+0,15x10’
30	2,00+0,38x10’	2,00+0,38x10’	1,00+0,19x10’
60	1,66+0,27x10’	1,00+0,25x109	2.00+0,21x10’	1,00+0,12x101

На 10-е сутки произошло снижение количества жизнеспособных клеток Staphylococcus sp. в переднем и заднем отделах кишечника до 2,33+0,42x10’ и 1,33±0,24х10⁹КОЕ/г, соответственно. В среднем отделе титр культуры увеличился на порядок и составил 2,67±0,51x10” КОЕ/г, В копролитах червя численность Staphylococcus sp. был значительно ниже, чем в кишечнике -1,00+0,15х 10³ КОЕ/мл (табл. 4).

К 30 суткам опыта отмечалось снижение титра изучаемой культуры во всех отделах кишечника животного. В среднем отделе кишечника титр уменьшился на порядок (табл. 4). В копролитах Staphylococcus sp. не был выявлен.

После содержания червей в течение 60-ти суток в переднем отделе кишечника титр Staphylococcus sp. снизился незначительно (табл. 4). В среднем отделе титр уменьшился в 2 раза по сравнению с данными 30-х суток и составил 1,00±0,25х10⁹ КОЕ/г, в заднем отделе, напротив, наблюдалось двукратное увеличение количества жизнеспособных клеток исследуемого штамма. При этом в копролитах титр Staphylococcus sp. был ниже на несколько порядков и составил 1,00+0,12x10³ КОЕ/г (табл. 4).

Интересным представляется тот факт, что в копролитах, выбрасываемых червем, резко снижается численность клеток Staphylococcus sp. по сравнению с кишечником, в связи, с чем организм красного калифорнийского гибрида (Eisenia jetida Andrei Bouche} можно рассматривать как санитарный барьер, ограничивающий распространение микроорганизма в окружающей среде.

Таким образом, организм червя может служить резервуаром для искусственно внесенных микроорганизмов. Нефтеразрушаюшие микроорганизмы, сохраняясь в кишечном тракте, могут способствовать повышению эффективности применения препаратов, используемых для очистки почв от нефтезагрязнения. Способность В thuringiensis аккумулироваться в кишечнике дождевых червей и сохранять способность к токсинообразованию позволяет делать вывод, что комплекс «энтомопатогенные бактерии - дождевые черви» может быть использован для решения проблемы более эффективного и рационального использования микроорганизмов для регулирования численности почвообитающий насекомых-вредителей.