Возможности диагностики болезни Крона в стадии обострения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови

А^т^альность.

Болезнь Крона – это хроничес^ое заболевание пищеварительно^о тра^та с се^ментарным трансм^-ральным ^ран^лематозным воспалением.

Распространенность болезни Крона в разных странах ^олеблется от 20 до 150 сл^чаев на 100 000 населения. Еже^одное появление новых сл^чаев болезни среди населения США и Западной Европы составляет 2–8 на 100 000 жителей. В Мос^овс^ой области в 1997 ^. они составляли: распространенность – 3,5 на 100 000 населения, заболеваемость – 0,3 на 100000 населения [1,2,13,14].

Несмотря на то, что этиоло^ия болезни Крона до сих пор остается неясной, пато^енез болезни из^чен достаточно основательно, и принято считать, что раз- витие болезни Крона зависит от взаимодействия трех инициир^емых фа^торов: восприимчивости ор^аниз-ма, состояния ^ишечной ми^рофлоры и состояния местно^о имм^нитета.

Диа^ности^а болезни Крона основывается на данных ^линичес^о^о обследования больных, рез^льта-тах лабораторных и инстр^ментальных методов. Основными инстр^ментальными методами являются рент^еноло^ичес^ий (ирри^ос^опия и из^чение пассажа бария по тон^ой ^иш^е), эндос^опичес^ий (^о-лонос^опия и эзофа^о^астрод^оденос^опия) и ^исто-ло^ичес^ое исследование. Для ^становления ^лини-чес^о^о диа^ноза достаточно положительно^о рез^ль-тата одно^о из трех ^^азанных методов. Использова- ние ^апс^льной эндос^опии еще нельзя отнести ^ надежному методу диагностики болезни Крона [8].

До настояще^о времени болезнь Крона все еще остается трудно диагностируемым заболеванием. Трудности диагностики связаны с возможной локализацией процесса в любом отделе желудочно-кишечного тракта, системными проявлениями болезни и неспецифическими клиническими симптомами. Это вызывает необходимость дальнейшей разработ^и новых способов диагностики данного заболевания. В 40 - 50% случаев болезнь Крона диагностируется во время оперативно^о вмешательства по повод^ рецидивирующих болей в животе или частичной кишечной непроходимости.

В ^ачестве одно^о из возможных направлений в лабораторной диа^ности^е болезни Крона нами были изучены особенности показателей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) сыворотки крови у больных в фазе обострения.

ВЭЖХ является современным высокоточным аналитическим методом, позволяющим проводить разделение и анализ компонентов в сложных биологических смесях. Она уже с успехом применяется для диагностики некоторых заболеваний [9, 11].

В качестве объекта исследования нами была выбрана сыворотка крови, как наиболее доступный материал, несущий в себе максимально возможную информационную нагрузку о состоянии систем и органов человека [3].

Цель исследования. Изучить возможность использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для диагностики болезни Крона, определить ч^вствительность и диа^ностичес^^ю точность метода.

Материалы и методы исследования.

В проведенном исследовании участвовали 29 пациентов. Все пациенты были разделены на 2 группы. В контрольную группу вошли 14 практически здоровых людей-добровольцев в возрасте от 23 до 54 лет.

Исследуемую группу составили 15 больных (11 мужчин и 4 женщины в возрасте от 21 до 56 лет) с болезнью Крона с верифицированным диа^нозом в стадии обострения, который оценивался по стандартному международному индексу (CDAI) активности болезни Крона [12]. Величина данного индекса составляла у больных от 235 до 310 единиц (среднее значение 268.1), что соответствует средней степени активности болезни. Диагноз болезни Крона у всех пациентов был подтвержден при помощи рентгенологического и/или эндоскопического и морфологического методов.

В исследование не включали больных с сопутствующей патологией в стадии декомпенсации или обострения. Сопутствующие заболевания у включенных в исследование больных были: хронический гастрит - у 5 лиц, хронический холецистит - у 3 больных, хронический панкреатит - у 1 больного, артериальная контролируемая гипертензия - у 3 лиц.

Забор ^рови проводили ^ пациентов натоща^ из вены в количестве 5-10 мл. Полученную сыворотку (не менее 2 мл) высушивали при 25°С до состояния сухой корочки и перемалывали до состояния гомогенного порошка. Далее брали навеску порошкообразной сыворотки в количестве 40 мг и проводили экстракцию 85%-ным метанолом - 200 мкл в течение 45 минут. После осаждения крупно- и среднемо-ле^^лярных бел^ов проводили центриф^^ирование смеси при ускорении 12000 об/мин с последующим отбором надосадочной жидкости. Полученный таким образом экстракт сыворотки крови подвергали хроматографическому исследованию.

При анализе использовали стандартн^ю методи^^ исследования на хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Новосибирск). Современные жидкостные хроматографы на микроколонках типа «Милихром А-02» представляют собой аналитический комплекс функционально объединенных устройств, обеспечивающих разделение жидких смесей, детектирование, идентификацию и количественный учет компонентов смеси. Контрольная программа встро-енно^о в спе^трофотометр ^омпьютера не доп^с^ает неправильных и несовместимых параметров, обеспечивая автоматический набор пробы, спектрофотометрическое детектирование, объективность и высокую точность анализов. Статистическая обработка массива хроматограмм выполнялась на основе многоуровневого кластерного анализа с формированием трехмерно^о образа нормы или патоло^ичес^о^о состояния при помощи специальной ^омпьютерной программы [10].

Рез^льтаты и обс^ждение

В исследование были в^лючены больные толь^о со средней степенью активности болезни Крона с CDAI от 235 до 310 единиц с целью формирования однородной группы для последующего спектрометрического анализа.

Основным ^линичес^им проявлением обострения болезни Крона ^ всех пациентов была боль в животе незначительная или умеренно выраженная в околопупочной или правой подвздошной области, не требующая приема анальгетических препаратов. Кроме того, у большинства больных (11 из 15) отмечали учащение стула до 4 - 6 и более раз в сутки без примеси крови. Субфебрильная температура присутствовала у 8 больных. Кожные изменения в виде узловатой эритемы проявились у 2 лиц, васкулита - у 2 лиц. Артралгия зафиксирована у 4 больных.

По результатам рентгенологического исследования кишечника и/или фиброколоноскопии, лапароскопии (у 2 больных) локализация процесса только в тонкой кишке (терминальный илеит) была у 6 больных, в тонкой и толстой кишке (илеит, сигмоидит, проктит) - у 6 больных, только в толстой кишке (сигмоидит) - у 2 больных, и только в прямой кишке - у 1 больного. У 3 больных в анамнезе была резекция участка кишечника по поводу болезни Крона 1-2 года назад.

После выполнения анализа сыворот^и ^рови ^ пациентов методом ВЭЖХ и статистичес^о^о анализа результатов полученных газохроматограмм при помощи кластерного анализа установлены диагностические показатели и критерии диагностики для пациентов с болезнью Крона, приведенные в табл. 1.

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают пра^тичес^и полное раз^раничение по^азателей ВЭЖГ ^ здоровых людей и пациентов с болезнью Крона, что демонстрируется на рисунке 1.

Проводя обсуждение результатов исследования, необходимо подчеркнуть, что сыворотка крови, несмотря на то что является очень сложной по своему составу, подчинена единым физико-химическим принципам строения и функционирования биологических жидкостей. При дегидратации молекулы и молекулярные ком-пле^сы претерпевают пространственные перемещения и ло^ализ^ются в стро^о определенном месте в форме фиксированной волны по ВЭЖХ. При этом каждая волна соответствует градиенту концентрации определенной группы ассоциированных молекул, близких по своей физико-химической структуре. В сыворотке крови подавляющее большинство моле^^л находится в виде надмолекулярных комплексов. Организационная аутоволновая структура дегидрированной сыворотки отражает спектр этих комплексов на хроматограмме. Фазовый переход биологической жидкости из неупорядоченного жидкого состояния в твердое путем высушивания организует определенный стохастический порядок, который становится наблюдаемым даже на макроскопическом уровне [4]. Волновые ритмы различного характера и качества являются одной из форм самоорганизации живой материи и ее взаимосвязи как с внутренней, так и с внешней средой [5, 6].

При любом заболевании наблюдаются изменения в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот, полипептидов и других соединений, которые поступают в кровь, и могут быть обнаружены [7]. Почти все заре-^истрированные на хромато^рамме пи^и являются олигопептидами, пептидами или низкомолекулярными белками. На этом основании существует вполне реальная возможность использования метода ВЭЖХ для лабораторной диагностики многих заболеваний, и в частности, болезни Крона.

Таким образом, в результате выполненных исследований показана возможность использования метода высо^оэффе^тивной жид^остной хромато^рафии для диагностики болезни Крона. Диалектически сам метод высокоэффективной жидкостной хроматографии уникально сочетает элементы анализа, определяемые хромато^рафичес^им разложением та^о^о биологического субстрата организма, как сыворотка крови на микроструктуры, и элементы синтеза, осуществляемые посредством многоуровневого кластерного анализа с формированием стабильного положения конечного образа в трехмерном пространстве.

Выводы

• 1.    Технология построения и анализа жидкостнохроматографических спектральных образов сыворот-^и ^рови может быть использована для диа^ности^и болезни Крона в активной фазе. Диагностическая чувствительность и точность составили 100%.

• 2.    Установлены новые закономерности в изменении спектральных свойств сыворотки крови при болезни Крона по сравнению со здоровыми пациентами. Создана динамичная база данных жидкостно-хроматографических образов сыворотки крови у пациентов с болезнью Крона, которая может быть использована в ^линичес^ой пра^ти^е для решения задач диагностики и дифференциальной диагностики.

Таблица 1

Рез^льтаты статистичес^о^о анализа диа^ности^и межд^ ^р^ппой пациентов с болезнью Крона и здоровыми людьми при помощи ВЭЖХ

Показатели	Контроль	Болезнь Крона
Количество пациентов	14	15
Истинная диагностика	14	15
Гиподиагностика	0	0
Чувствительность диагностики (%)	100	100
Диагностическая точность (%)	100
Критерий хи-квадрат	34,5166
Уровень вероятности (%)	99,78

Рис. 1. ВЭЖХ-спектрометрические образы здоровых людей (темная окраска) и пациентов с болезнью Крона (светлая окраска).