Возможности использования многофакторного эксперимента в исследовании эколого-физиологических характеристик растений

Широкое почвенно-климатическое разнообразие территории России, даже в пределах одного географического региона, диктует необходимость выведения сортов, эколого-физиологическая характеристика которых отвечает конкретным условиям их выращивания [6], [16]. Это требует всестороннего знания разных показателей. Но если необходимые почвенно-климатические данные в настоящее время могут быть получены в достаточно полном объеме, то эколого-физиологическая характеристика генотипа (сорта) – в лучшем случае только на качественном уровне. В то же время возрастание роли экологических показателей в характеристике генотипа, особенно в связи с изменениями климата, требует их перевода из качественного описания в количественное.

В настоящее время эколого-физиологическая оценка растений в естественных и искусственно созданных ценозах чаще всего базируется на многолетних метеоролого-фенологических наблюдениях, показателях продуктивности и морфо-анатомической характеристике растений. Сами объекты являются результатом длительного периода их жизнедеятельности, включающего широкую амплитуду влияния комплекса фак

торов внешней среды. Это не позволяет определить их дифференцированного воздействия на формирование конкретных функций и структур организма. Физиологические показатели используются гораздо реже, в то время как именно они отражают пластичность организма и возможность его выживания в экстремальных условиях среды. При этом эпизодические, многократные их определения в природных условиях или в однофакторном эксперименте не позволяют прогнозировать динамику процесса из-за влияния на него различного сочетания сопутствующих факторов среды и не менее сильного их последействия. Даже многолетний планируемый сбор экспериментального материала в естественных условиях внешней среды со строгой регистрацией ее динамики и последующим регрессионным анализом не гарантирует количественного определения влияния конкретного фактора на исследуемый биологический процесс из-за возможного отсутствия нужного сочетания интенсивности факторов внешней среды в собранном материале [ 9 ] .

Развитие фитотроники, обеспечивающей получение регулируемых условий внешней среды, и вычислительной техники предоставило возмож- ность осуществления в биологии системных исследований и проведения активных многофакторных планируемых экспериментов. Это позволяет перейти от изучения качественных зависимостей к их количественным выражениям, к определению силы и закономерности влияния исследуемых факторов среды различной интенсивности на биологические процессы, получить экологическую характеристику генотипа, сорта [9].

Широко распространенный в биологии молекулярно-биохимический подход вскрывает состав и структуру объекта, но не может ответить на вопрос об их взаимодействии, об эмерджент-ных свойствах системы, возникающих лишь на достаточно высоком уровне ее организации [ 7 ] . Ответы на эти вопросы могут быть получены только на основе системного подхода [ 14 ] , так как для биосистемы первичной является организующая роль в отношении составляющих ее взаимосвязанных элементов, свойства которых в значительной мере обусловлены вхождением в систему. Элементы не играют однозначной роли в функционировании биосистемы: в одних и тех же процессах могут участвовать разные составляющие, и наоборот, одни и те же элементы могут осуществлять разные функции. Если аналитический метод позволяет судить о составе объекта, то системный подход позволяет показать, как организована его жизнедеятельность, даже абстрагируясь от его состава. Информативность молекулярного подхода возрастает в сочетании с системным и, главное, получает реальную достоверность при наличии сведений о состоянии живого объекта, зависящего от многих внутренних и внешних факторов. Так, один и тот же внешний фактор оказывает разное влияние на направленность биохимических процессов в зависимости от его интенсивности, вида и даже генотипа растений. В частности, температура 30 ° С обеспечивает, при других соответствующих условиях внешней среды, оптимум нетто-фотосинтеза на ранних фазах развития кукурузы, в то же время у всходов огурца индуцирует процессы адаптации к теплу, а у рассады капусты белокочанной – повреждения. Аналогичная картина наблюдается и при действии умеренных температур: так, в частности, температура 20 ° С, обеспечивающая оптимум видимого фотосинтеза у большинства сельскохозяйственных культур, у хлопчатника является закаливающей к холоду, а у картофеля и овсяницы луговой - к теплу [ 4], [20], [21 ] .

Необходимость достижения максимальной информативности проводимых опытов и представления полученных данных в сжатой и наглядной форме привела к идее планирования эксперимента, то есть к использованию определенных схем получения статистически надежных данных. Результаты экспериментов, поставленных по таким схемам, могут быть представлены весьма компактно, в виде поли- номов – уравнениями регрессии. Последние и являются, в сущности, математическими моделями исследуемых процессов с эмпирическими константами. Успешность эмпирического моделирования и объективность моделей определяются качеством эксперимента, полнотой охвата им многообразия связей растения со средой. Однако привлечение большего числа переменных факторов обуславливается длительностью и трудоемкостью эксперимента и возможностью обработки полученных результатов [13], [19].

Одним из путей решения проблемы являются исследования закономерностей влияния факторов внешней среды на биологические процессы в регулируемых условиях среды в активном эксперименте с планированием схем опытов, позволяющих получить статистически надежные данные при ограниченном числе вариантов и, соответственно, сокращенных трудозатратах. Однако радиус обследуемого пространства не должен выходить за пределы технических возможностей установки и биологических особенностей объекта – его зональной реакции на влияние интенсивности факторов внешней среды, что наиболее обстоятельно изучено на примере температурного фактора [3], [8]. Анализ литературных данных и проведенные исследования показали [4], [5], [21], что диапазон действующих в природе температур по влиянию на растения подразделяется на пять зон – фоновую и по две закаливающих и повреждающих в областях повышенных и пониженных их значений. Границы зон и потенциальная терморезистентность растений находятся под контролем генома и специфичны для генотипа, но изменяются в онтогенезе и под влиянием условий внешней среды.

Изменения температуры в пределах фоновой зоны не оказывают влияния на направленность метаболизма и терморезистентность растений и не имеют последействия. Действие более низких или высоких, чем фоновой зоны, температур индуцирует изменение метаболизма растений и повышение их терморезистентности. Величина этих изменений и их последействие зависят от дозы воздействия и биологических особенностей генотипа. Эффект действия закаливающих температур возрастает по мере удаления от границы фоновой зоны, а по мере повышения устойчивости растений происходит расширение этой зоны. Повреждающие температуры вызывают нарушение энергообеспечения клеток и в конечном итоге их гибель.

Особое значение при разработке программы многофакторного планируемого эксперимента имеет выбор исследуемых показателей – «отклика», функция которого должна всесторонне отражать свойство объекта, определяться количественно, быть статистически эффективной, иметь физический смысл и легко вычисляться. Наиболее объективным показателем реакции растений на условия среды выступает хозяйственно по- лезный урожай, но, так как он является итогом жизненного цикла растений в вегетационный период, вклад в него отдельных факторов оценить практически невозможно. Поэтому в активном многофакторном планируемом эксперименте для определения физиолого-экологической характеристики генотипа (сорта) наиболее объективным показателем реакции на условия внешней среды является СО2-обмен интактных растений, оперативно отражающий реакцию растений на изменения условий внешней среды и доступный для инструментального непрерывного измерения без контакта с растением [12], [18].

В зависимости от задачи исследования для изучения влияния на растения могут быть выбраны разные факторы внешней среды: температура почвы и воздуха, свет, фотопериод, концентрация углекислоты, влажность, физиологически активные вещества и т. д.

Так как факторы внешней среды имеют различную размерность - ° С, Вт/м², клк, г и т. д., реализация активного эксперимента возможна лишь в том случае, если все переменные будут выражены в сопоставимых единицах. Это достигается переводом реальных единиц в относительные, нормированные. Для этого верхний уровень исследуемого фактора в опыте обозначается как +1, минимальный – 1, а средний – обычным 0.

Совместная обработка данных эксперимента методом нелинейного регрессионного компьютерного анализа с применением соответствующих программ позволяет определить коэффициенты уравнения регрессии в кодированных единицах, которые легко пересчитываются в натуральные. Коэффициенты уравнения в кодированных единицах весьма информативны: они отражают силу влияния фактора (членов уравнения) на реакцию, отклик растения. Ведущим является фактор с наибольшей величиной коэффициента.

Планирование многофакторных экспериментов, методики их проведения и обработки экспериментального материала проводится на основании теории планирования экспериментов [1], [9]. Планы предусматривают обследование всего пространства переменных факторов при наименьшем числе точек опытов, но без потери точности. В качестве примера приводим план двухфакторного эксперимента (табл. 1).

Исследуемые растения выращиваем в регулируемых условиях среды в песчаной культуре при поливе питательным раствором, дополненном микроэлементами, при оптимальных для исследуемой культуры рН, фотопериоде, температуре воздуха и почвы и интенсивности освещенности. Посев проводим калиброванными проросшими семенами. По достижению заданной схемой плана эксперимента фазы развития сосуды с растениями, соответствующими по внешним признакам стандарту (число листьев, их размер, диаметр и высота стебля, отсутствие внешних повреждений и т. д.), переносим в установку для исследования СО2-газообмена, где по выбранному плану проводим активный многофакторный эксперимент. Ограниченное количество растений в опыте и отзывчивость «отклика» на всевозможные отклонения в исследуемом материале требует высококачественной подготовки, обеспечивающей его однородность. Поэтому, помимо проверки на соответствие внешнему стандарту, желательно определение выравнен-ности по СО2-обмену при условиях выращивания, которое не должно превышать 10 %.

Таблица 1

Несимметричный квази-D-оптимальный план

Ступень плана	Уровни факторов (X1 – освещенность, X2– температура воздуха)		Y, отклик растения
	X1	X2
1	-1	-1	Y1
2	1	-1	Y 2
3	-1	1	Y3
4	1	1	Y4
5	1	0	Y5
6	0	1	Y6
7	0	0	Y7

Погрешность измерения интенсивности освещенности и температуры не должна превышать 0,5 %, концентрации углекислоты и скорости воздушного потока – 2,5 %. Во время 40–60минутной экспозиции на каждой ступени плана при помощи газоанализатора регистрируем значение разности содержания углекислоты в токе воздуха на входе и выходе из установки и пересчитываем на еди-ницу сухого вещества целых растений. При условии выравненности материала и указанной выше точности измерения экспериментальные модели имеют погрешность в пределах оптимальных зон факторов до 5 %. Расчет ассимиляции углекислоты растениями на каждой ступени двухфакторного эксперимента по несимметричному квази-D-оптимальному трехуровневому плану и обработка экспериментальных данных методом множественного регрессионного анализа позволяют получить модель влияния исследуемых факторов внешней среды (например, интенсивности света и температуры) на нетто-фотосинтез интактных растений:

NP = a₀ + a₁E + a₂t + a₃Et + a₄ E² + a₅t², где NP – интенсивность нетто-фотосинтеза, мг CO₂ на 1 г сухой массы в 1 ч; Е – освещенность, Вт/м²; t – температура воздуха, ºС; a₀–a₅ – коэффициенты, определенные по опытным данным.

Желательно иметь интенсивность освещенности растений в установке до 600 Вт/м², близкой по качеству к естественному свету, которая может быть обеспечена тремя лампами ДРЛФ-400, тремя галогеновыми лампами накаливания КГ-1000 или КГ-500 и водным экраном со слоем воды 3-5 см [ 17 ] .

Силу влияния различной интенсивности фактора на нетто-фотосинтез интактных растений рассчитываем по тангенсу угла наклона температурных и световых кривых на интересующей части исследуемого фактора [11]. За фоновую зону принимаем условия среды, обеспечивающие интенсивность газообмена выше 90 % от максимального [10], к которой примыкают зоны закаливания [4].

Определение эколого-физиологической характеристики нетто-фотосинтеза ряда сортов 3 видов растений показало (табл. 2), что как по уровню потенциального видимого фотосинтеза, так и по светотемпературным условиям, обеспечивающим его достижение, исследуемые сорта значительно различаются. Наиболее высокий потенциальный максимум нетто-фотосинтеза имеют бобовые, что подтверждают литературные данные о его роли у азотфиксирующих культур [ 15 ] . В то же время проведенные исследования показали значительное внутривидовое эколого-физиологическое разнообразие, в ряде случаев перекрывающее межвидовое.

Таким образом, использование многофакторных планируемых экспериментов в регулируемых условиях внешней среды на основе системного подхода позволяет перейти от качественной к количественной характеристике СО2-газообмена генотипа. Это может найти применение в селекционной работе, интродукции растений, прогнозировании влияния изменения климата на границы ареалов распространения видов, географическом и внутрихозяйственном размещении сельскохозяйственных культур, особенно в защищенном грунте и т. д.

Изучение эколого-физиологической характеристики ряда одновидовых сортов показало их широкое внутривидовое разнообразие. Поэтому нельзя судить об экологической характеристике вида по изучению одного из его представителей, а необходимо определить ее у ряда контрастных по этому показателю экотипов или сортов.

Таблица 2

Потенциальный максимум нетто-фотосинтеза интактных растений на ранних фазах их развития и светотемпературные условия внешней среды, обеспечивающие его достижение

Вид, сорт	Нетто-фотосинтез, мг СО2 /г ∙ ч	Освещенность,	Температура воздуха, ºС
		Вт/м2	макси- опти мальная мальная

Картофель ( Solanum tuberosum )

с. Пушкинец	10,6	500	24	15–35
с. Елизавета	11,5	420	17	6–28
с. Нида	13,3	440	20	12–28

Клевер ( Trifolium pratense L. )

с. Тимирязевец	18,1	390	20	12–28
с. Нива	20,2	460	24	15–34
с. Вик	30,0	550	32	20–45

Гречиха ( Fagopyrum esculentum M. )

с. Богатырь	18,0	470	45	8–24
с. Тройка	20,0	420	18	11–24
с. Молва	16,0	380	10	4–21

Учитывая, что фотосинтез является одним из основополагающих процессов продуктивности растений, чутко реагирующим на изменения внешней среды, интенсивность ее факторов, обеспечивающих достижение оптимума нетто-фотосинтеза интактных растений, можно рассматривать как экологический оптимум исследуемого генотипа. При этом статистические модели, полученные на основании планируемых многофакторных экспериментов и связывающие «отклик» растения с условиями внешней среды, являются эколого-физиологической характеристикой генотипа (сорта) на исследуемой фазе его развития.

POSSIBILITY OF USING MULTIFACTOR EXPERIMENTS IN STUDY OF PLANTS’ ECOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS