Возможности компьютерной цитоморфометрии эозинофилов при эозинофилиях различного генеза

¹Введение. В последние годы формируются представления о выраженном цитотоксическом потенциале эозинофилов (Эо), превышающем другие клетки крови, что объясняет первостепенное значение Эо в антипаразитарных реакциях и их повреждающую роль при развитии противопаразитарного иммунитета [1].

Эо в крови присутствуют в основном в виде зрелых форм (сегментоядерных), имеющих, как правило, двудольчатое ядро, в их цитоплазме кроме всех основных органелл имеются специфические и неспецифические гранулы. Специфические гранулы хорошо окрашиваются кислыми красителями, в одном эозинофиле содержится около 200 специфических гранул.

В настоящее время ряд авторов выделяет две основные субпопуляции Эо, различающиеся по плотности. Эо нормальной плотности получили название нормодансных, пониженной – гиподансных. Эо с пониженной плотностью обладают мембранными рецепторами к IgE с относительно слабым аффинитетом (CD23). Мембраны Эо с пониженной плотностью обладают рецепторами и к отдельным компонентам комплемента, в частности С1 и С3, интерлейкину-2, фармакологически активным веществам (эстрадиолу, гистамину, кортикостероидам) и различным хе мотаксическим агентам. Экспрессия всех указанных

355000, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д.1

Тел.: (8652) 35-50-68.

рецепторов чрезвычайно изменчива. Она может увеличиваться или уменьшаться под влиянием различных факторов. При повышении экспрессии этих рецепторов увеличивается способность Эо выделять различного рода медиаторы, содержащиеся в гранулах данных клеток. Их увеличение обусловливает формирование высокого микробицидного потенциала, действующего не только в отношении инородных субстанций, но и окружающих тканей [1].

Известно, что функциональное состояние клеток и, в частности, Эо можно оценивать, изучая морфологические особенности этих клеток. При этом морфология форменных элементов крови давно признана в качестве важнейшего клинического показателя, однако изучение характеристик морфофункциональных особенностей Эо в связи с малым количеством клеток в препарате другими исследователями не проводилась.

Целью исследования явилось изучение особенностей изменения геометрических и оптических показателей компьютерной цитоморфометрии Эо у детей и взрослых при эозинофилиях различного генеза.

Методы. Для решения поставленных в исследовании задач обследовано 109 пациентов Гельминтологического центра Ставропольской Краевой клинической инфекционной больницы в период с 2005 по 2009 год. Из них 29 детей (средний возраст 8,4±1,6 лет) – 1 группа, 38 взрослых (средний возраст 44,7±6,1 лет) – 2 группа, с установленным титром антител к антигенам токсокар, и 13 человек (средний возраст 41,0±7,1 лет) с эозинофилией непаразитарного генеза – 3 группа.

Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и наркотическая зависимость. Все пациенты были обследованы до назначения терапии.

Группы контроля составили 19 здоровых детей – 4 группа (средний возраст 7,2±0,7 лет) и 10 взрослых (средний возраст 43,7±2,5 лет) – 5 группа, сопоставимыми по полу и возрасту характеристиками. По результатам расширенного обследования и данным декретируемой диспансеризации, обследованные, были признаны практически здоровыми.

Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали трилоном В) с соблюдением всех правил преаналитического этапа.

Компьютерное цитоморфометрическое исследование Эо проводилось на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Россия), состоящего из микроскопа с тринокуляром «NIKON», цифровой фотокамеры «Delta Pix – 300», персонального компьютера и программы «Анализ мазков крови».

Система Мекос-Ц позволяет в диалоговом режиме ввода кадров поля зрения сформировать общую галерею изображений интересующих клеток. Принцип работы прибора не отличается от других систем компьютерного анализа изображения [2]. Конечные результаты исследований включают в себя анализ геометрических параметров клеток (средний диаметр, фактор формы, площадь поверхности и.т.д.), текстурных характеристик, оценку фотометрической неоднородности однородной популяции клеток в цитологическом препарате [3]. Данные характеристики используются для количественной оценки гетерогенности популяции Эо и повышении информативности анализа выраженности патологии.

В данном исследовании морфометрическая оценка осуществлялась по следующим параметрам: диаметр (D), площадь клетки (S) – наиболее объективные показатели, содержащие информацию о размерах клетки и независящие от ее сложного контура. Площадь рассчитывается как сумма всех точек (пикселов), составляющих изображение, умноженная на масштаб изображения. Этот показатель отражает размеры. Значение площади и диаметра Эо здоровых людей имеют характер логарифмического распределения. Фактор формы (ФФ) – отношение квадрата периметра к площади клетки. Этот показатель характеризует изрезанность краев эозинофила. Ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС) – отношение площади ядра к площади цитоплазмы исследуемой клетки. Учитывая, что изменение этого расчетного коэффициента может зависеть от размеров ядра и количества цитоплазмы, мы сочли необходимым исследовать показатель коэффициент выпуклости ядра (КВЯ) – расчетная единица соотношения радиуса клетки к диаметру ядра, которая характеризует степень выбухания ядра к размерам цитоплазмы, и возрастает при увеличении размеров ядра. Индекс поляризации (ИП) характеризует степень эллиптичности объекта распластанного на стекле.

При анализе цитологических изображений, для оценки неоднородности популяции клеток цитологического препарата, проведено измерение текстурных характеристик объекта, в частности зернистости. Для оценки параметров зернистости применяли распределение гистограммы яркости по объекту с помощью показателя удельной оптической плотности (УОП).

УОП измерялась в трех спектральных диапазонах видеокамеры – синем (УОПС), зеленом (УОПЗ), красном (УОПК). Оптической плотности по каждой из трех компонентов спектра соответствует своя область поглощения. Если область поглощения вещества лежит в видимой части спектра, то оно кажется окрашенным, при этом окраска определяется цветом тех лучей, которые вещество поглощает. Величина УОПС по синей компоненте при изучении Эо, отражает степень насыщенности клеток гранулами, а УОПК – степень их функциональной активности.

В настоящей работе статистическую обработку полученных данных проводили с привлечением метода описательной статистики. Определяли основные характеристики описательной статистики: среднее (Х), ошибку среднего (м) и стандартное отклонение (δ). Достоверность различия средних рассчитывали по критерию Стьюдента (t) для коэффициента вариации уровень значимости Р выбран менее 0,05.

Результаты. Установление титра антител к антигенам токсокар, выполнялось при помощи отечественной иммуноферментной тест-системы «Тиатрис», выпускаемой ЗАО «Вектор-Бест» (чувствительность 91%, специфичность 85%), В результате статистической оценки полученных данных установлено, что в группах обследованных пациентов с наличием титра антител к токсокарам и здоровых людей имеются некоторые различия. Результаты морфометрического исследования варьируют в широких пределах, что свидетельствует о выраженной морфологической и функциональной гетерогенности популяции эозинофилов периферической крови. Сравнительный анализ данных, полученных с помощью компьютерной цитофотометрии Эо, выявил особенности морфофункциональных показателей клеточного состава среди группы здоровых детей и группы детей, имеющих в крови антигены к антителам токсокар. Данные анализа внесены в таблицу 1.

У детей-токсокарононосителей отмечается достоверное увеличение количества ЭО, что становится более убедительным при сравнении абсолютного числа ЭО (увеличение в 22 раза). При этом наиболее достоверные различия получены при сопоставлении геометрических показателей пациентов 1 и 4 групп: выявлено уменьшение средней S (p<0,001), среднего D клеток (p<0,001) и ФФ (p<0,001), характерное для Эо детей-токсокароносителей. ЯЦС у детей в группе 1 увеличено за счет уменьшения количества цитоплазмы в клетке. Это подтверждается направленностью к снижению среднего КВЯ у здоровых обследуемых. УОП у детей по красной, зеленой, синей компоненте не выявлено, однако, отмечаются тенденции усиления оптической плотности по красной компоненте и ослабление по синей, что характеризует усиление функциональной активности Эо у детей-токсокароносителей.

Таким образом, картина периферической крови у детей-токсокароносителей характеризуется появлением значительного количества функционально активных Эо, морфологически характеризующихся эозинофильным микроцитозом с увеличением выпуклости ядра.

При сравнении эозинофильных показателей в группах взрослых людей с выявленным специфическим титром антител к антигенам токсокар и данных здоровых людей, удалось установить, что тождественная тенденция к снижению данных показателей сохраняется, но менее выражена (табл. 2).

У взрослых обследуемых отмечается достоверное увеличение абсолютного и относительного коли- чества Эо периферической крови, снижение средних размеров клетки, уменьшение содержания цитоплазмы при увеличении размеров ядра. Так же выявлено снижение, у токсокароносителей по сравнению с контрольной группой, функциональной активности Эо и меньшая насыщенность гранулами, о чем свидетельствует снижение УОПС и повышение УОПК.

В группах сравнения лиц с эозинофилией различного генеза и токсокароносителей, количество эозинофилов закономерно увеличивается. Сравнивая геометрические показатели у лиц с эозинофилией и токсокароносителей, следует отметить некоторую разницу в значениях средней S и среднего D: у лиц с эозинофилией размер клетки больше, а у токсока-роносителей меньше, чем у здоровых обследуемых. Вариация показателя ФФ, при сопоставлении значений в данных группах не установлена. Анализ показателя ЯЦС в группе пациентов с эозинофилией по сравнению с группой носителей антител к токсокаро-зу выявил аналогичные изменение значения в виде достоверного увеличения показателя. Тождествен- ность показателей, характеризующих функциональную активность клеток, определяется более высоким значением УОП по красной компоненте в группе пациентов-токсокароносителей. При этом изменения эозинофильных показателей пациентов с эозинофилией различного генеза показывают увеличение геометрических размеров клеток, большую функциональную активность как по сравнению с данными токсокароносителей, так и со здоровыми обследуемыми.

Обсуждение . В работе дана оценка изменение геометрических и цветояркостных параметров цифровых изображений эозинофилов. В ходе исследований получены данные о морфологической и функциональной гетерогенности в архитектонике изучаемых клеток. Вместе с тем, при наличии очевидных признаков достоверного увеличения абсолютного и относительного числа циркулирующих эозинофилов, выявлены признаки морфологической перестройки эозинофильной популяции – уменьшение размеров клетки, смещение ядерно-цитоплазматического со-

Таблица 1

Изменение показателей КЦМЭо в группах детей-токсокароносителей и здоровых обследуемых (Х±м, р)

Показатели, ед.измерения	1 группа (п=29)	4 группа (п=19)	Р
Относительное количество Эо, 106 /л	20,86±4,18	3,21±0,47	p<0,001
Абсолютное количество Эо	3916±153,4	174,50±26,40	p<0,001
Средняя площадь, мкм2	90,0±2,10	184,36±3,28	p<0,001
Средний диаметр, мкм	10,5±0,65	15,22±0,30	p<0,001
Фактор формы, усл. ед.	20,8±0,40	23,28±0,54	p<0,001
Ядерно-цитоплазматическое соотношение, усл.ед.	2,07±0,29	0,499±0,01	p<0,001
Коэффициент выпуклости ядра, усл. ед.	0,176±0,04	0,206±0,02	p>0,1
Индекс поляризации, усл. ед.	0,063±0,01	0,142±0,01	p<0,05
УОПК, усл.ед.	0,469±0,04	0,323±0,01	p<0,001
УОПЗ, усл.ед.	0,656±0,04	0,512±0,03	p>0,1
УОПС, усл.ед.	0,256±0,01	0,310±0,03	p>0,05

Таблица 2

Изменение показателей КЦМЭо пациентов с эозинофилией различного генеза и здоровых обследуемых (Х±м, р)

Показатели, ед.измерения	2 группа (п=38)	5 группа (п=10)	3 группа (п=13)
Относительное количество Эо, 106 /л	16,17±4,84 *	2,43±0,37 **	19,4±2,89
Абсолютное количество Эо	1725±502,03 *	142,9±38,85 **	1585,2±525,3
Средняя площадь, мкм2	132,0±3,7	140,5±3,6 **	152,78±3,2 ***
Средний диаметр, мкм	12,89±0,2	13,25±0,26	13,87±0,33 ***
Фактор формы, усл. ед.	23,08±0,66	22,0±0,21	23,03±0,88
Ядерно-цитоплазматическое соотношение, усл.ед.	0,955±0,11 *	0,689±0,09	0,628±0,03 ***
Коэффициент выпуклости ядра, усл. ед.	0,189±0,02	0,230±0,03	0,209±0,02
Индекс поляризации, усл. ед.	0,127±0,02	0,121±0,03	0,137±0,03
УОПК, усл.ед.	0,408±0,13 *	0,275±0,03	0,303±0,04 ***
УОПЗ, усл.ед.	0,545±0,05	0,656±0,06	0,535±0,05
УОПС, усл.ед.	0,262±0,02	0,276±0,02	0,283±0,02

* – в группах 2 и 5; ** – в группах 3 и 5; *** – в группах 2 и 3.

отношения в сторону уменьшения у лиц с выявленным титром антител к антигенам токсокар. Более выраженные изменения наблюдаются в группах обследуемых детей.

Заключение. Таким образом, в результате внедрения метода компьютерной цитоморфометрии появилась возможность детального изучения клеток и выявления различий между эозинофилами групп обследуемых. В ходе исследований получены данные о морфологической и функциональной гетерогенности изучаемых клеток. Эозинофилы у токсокароносите-лей характеризуются меньшими размерами, боль- шей насыщенностью гранулами с меньшей функциональной активностью.