ВОЗМОЖНОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ НА ПРИМЕРЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ЙОГУРТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ДОБАВКАМИ

Молочная продукция (включая масложировую, сырную, кисломолочную и т.п.), наряду с мясной, растительной и иной пищевой продукцией, является одной из важнейших составляющих питания человека. Производство молока в России неуклонно растет и в настоящее время приближается к цифре 32 млн тонн в год, а потребление молока и молочной продукции на душу населения в РФ составляет около 230 литров в год. При этом вследствие все более интенсивного развития пищевых технологий не только количество, но и качество молочной продукции в последнее время начинает иметь все более важное значение для обеспечения здорового и полноценного питания населения. Это подтверждает и то, что ежегодно во всем мире происходит увеличение количества исследований, посвященных молочным продуктам и их влиянию на здоровье человека (рис. 1). Причем одной из наиболее актуальных тем этих публикаций является то, как употребление кисломолочных продуктов влияет на состояние сердечно-сосудистой системы и желудочнокишечного тракта человека.

Лактобактерии и бифидобактерии являются наиболее типичными представителями анаэробных молочнокислых бактерий, присутствующих в составе нормальной микробиоты человеческого организма [1]. Кисломолочные продукты, при изготовлении которых в качестве заквасок используются молочнокислые бактерии, не только имеют множество полезных для человека питательных и профилактических свойств, но и способствуют поддержанию необходимого количественного и видового состава микробиоты человека. Вследствие этого кисломолочные продукты входят во все основные рекомендации и руководства по здоровому питанию и образу жизни, где их рекомендуется включать в рацион взрослых и детей с первых лет жизни [2].

Однако вследствие развития технологий производства кисломолочных пищевых продуктов они включают в себя, а также в свои упаковки все большее количество функциональных добавок и посторонних веществ, имеющих различное происхождение и уровень токсичности для здоровья человека [3]. Поэтому контролю качества и безопасности пищевых продуктов в последние годы уделяется все большее внимание.

3.500

3.000

2.500

2.000

1.500

1.000

500 0

liluliHI

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021

Публикации g Во всем мире 20.179

• ■    Европа              8.887

• ■    Российская Федерация 557

Рис. 1. Статистика публикаций в Scopus, посвященных исследованию кисломолочных продуктов

При этом в силу многообразия и сложности состава этих продуктов, а также развития технологий их производства все труднее становится отслеживать уровни содержания в анализируемых продуктах микробных патогенов, тяжелых металлов, различных пищевых добавок, биотоксинов, остатков агрохимикатов и других потенциально опасных составляющих. Поэтому требуется разработка все более эффективных инструментов для анализа различных пищевых продуктов [4–8].

Для исследования газового состава ферментированных молочных продуктов может быть использован метод газовой хроматографии (ГХ), который позволяет получить разделения компонентов сложных смесей [9–11]. Однако идентификация обнаруживаемых этим методом компонентов по времени их удержания не является достаточно достоверной, а время анализа составляет 10–30 мин.

Метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) позволяет разделять и идентифицировать сложные смеси. Данный метод позволяет определять и анализировать состав продуктов питания, а также исследовать его на безопасность пищевых добавок [12, 13]. Однако метод ГХМС является достаточно сложным в реализации, дорогостоящим и времязатратным (процедура анализа занимает от 10 до 30 мин). Поэтому для экспресс-диагностики в режиме реального времени может быть реализован метод газовой масс-спектрометрии (ГМС). При этом информационным показателем качества пищевых продуктов становится фингерпринт (отпечаток) анализируемого образца без полной идентификации составляющих его компонент. Вследствие чего получаемая в результате ГМС-анализа совокупность многомерных данных требует математической обработки, для которой в настоящее время наиболее широко применяются дискриминантный анализ и метод главных компонент [14, 15].

Помимо самой молочной продукции, контроля качества требуют также и материалы, используемые производителями этой продукции для ее упаковки. Номенклатура таких материалов в настоя- щее время весьма разнообразна, что требует индивидуального подхода к выбору упаковки с учетом ее свойств. Одним из наиболее распространенных видов пластика, используемого для изготовления одноразовых упаковок пищевых продуктов широкого потребления, является полиэтилентерефталат (PET). Срок годности упаковок, изготовленных из РЕТ, — 1 год. Такой вид пластика запрещено использовать повторно. Кроме того, РЕТ пропускает в бутылку ультрафиолетовые лучи и кислород, а наружу — углекислоту, что ухудшает качество продукта и приводит к сокращению срока его хранения.

Целью настоящей работы стало исследование возможностей применения газового масс-спектрометрического анализа с последующей интеллектуальной математической обработкой получаемых данных для оценки качества образцов различной промышленно выпускаемой молочной продукции на примере выпускаемых разными производителями йогуртов с различными добавками и вкусовыми наполнителями (ВН), а также материалов, используемых для их упаковки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования в настоящей работе было выбрано 7 образцов промышленно производимых йогуртов с различными добавками, список которых приводится ниже:

образец № 1 — йогурт "Epica", без ВН, производитель "Эрманн" (Россия);

образец № 2 — йогурт "Viola", без ВН, производитель "Виола" (Россия);

образец № 3 — йогурт "Агуша", без ВН, производитель АО "Вимм-Билль-Данн" (Россия);

образец № 4 — йогурт "Слобода", с ВН, производитель ОАО ЭФКО (Россия);

образец № 5 — йогурт "Эконива", с ВН, производитель АО "Московско–Медынское агропромышленное предприятие" (Калужская область, Россия);

образец № 6 — йогурт "Чудо", с ВН, производитель АО "Вимм-Билль-Данн" (Россия);

образец № 7 — йогурт "Агуша", с ВН, производитель АО "Вимм-Билль-Данн" (Россия).

В процессе анализа от каждого из вышеупомянутых образцов с помощью пробозаборных устройств (ПЗУ), в качестве которых мы использовали пластиковые шприцы объемом 20 мл, отбирались его испарения (путем протыкания крышки герметично упакованного образца иглой ПЗУ, при этом конец иглы не касался поверхности продукта). Затем отобранные газообразные пробы из ПЗУ через систему прямого ввода вводились в масс-спектрометр МС7-200 [16, 17].

Далее из оставшихся в упаковке образцов в измерительные емкости (ИЕ), в качестве которых мы использовали 50 мл пластиковые одноразовые стаканчики, отливалось по 35 мл продукта, крышки ИЕ завинчивались, и упомянутые ИЕ приводились в состояние "просроченных". Для этого они подвергались "ускоренному ферментированию" путем термостатирования в течение 3 суток при +40 °С. После истечения срока термостатирования из ИЕ, содержащих "ферментированные" таким способом образцы анализируемой продукции, также отбирались пробы испарений и регистрировались масс-спектры этих проб.

Кроме того, проводился МС-анализ выделений упаковок анализируемых образцов. Для этого упаковки отмывались дистиллированной водой, за- тем, высушивались, разрезались, помещались в сухие чистые ИЕ (каждая упаковка в отдельную ИЕ) и инкубировались в жидкостном термостате при +70 °С в течение 5 мин. Далее в ПЗУ отбирались пробы испарений образцов упаковочных материалов, содержащихся в упомянутых ИЕ, и отобранные газообразные пробы через систему прямого ввода вводились в масс-спектрометр.

И наконец после получения масс-спектров анализируемых образцов в "свежем" и ускоренно "просроченном" состояниях в дополнение к "классическим" методам анализа полученных результатов для обработки и визуализации полученных данных нами был использован "метод главных компонент" (PCA). Этот метод часто используют для анализа наборов данных с большим количеством переменных, поскольку он позволяет сохранить максимальное количество информации о массиве данных, используя минимальное количество переменных. Данный метод позволяет уменьшить число признаков, выбрав самые изменчивые из них, для чего производит переход к новым переменным, называемым "главными компонентами". Для этого, согласно PCA, сначала на основе исходного массива данных рассчитывается "ковариационная матрица", отражающая дисперсию исходных многомерных данных. При этом каждая отдельная позиция в указанной матрице отражает степень корреляции между отдельными признаками анализируемых образцов.

Табл. Интенсивности пиков (в отн. ед.), зарегистрированных в масс-спектрах для образцов "свежих" (С) и "ускоренно просроченных" (К) йогуртов

Образец	Массовое число пика (Да)
	55	56	57	58	59	60	61	64	67	69	70	71	72	73	74	84	85	88
1K	2.62	2.9	2.26	1.1	0	0.32	0	0.38	0.54	1.2	2	1.43	0.46	0	0	1	0.9	0
1C	0.3	0.28	0.19	0.62	0	0.4	0	0.18	0.07	0.05	0.18	0.01	0.13	0	0	0.01	0.01	0
2K	0.33	0.94	0.39	1.56	0	1.12	0.65	0.35	0.01	0.15	1	0.2	2.7	0.2	0	0.01	0.01	0.3
2C	0.3	0.46	0.4	0.4	0	0.25	0.01	0.08	0.07	0.2	0.15	0.2	0.07	0.01	0	0.1	0.03	0.01
3K	0.2	0.25	0.25	0.88	0	0.46	0.08	0.1	0	0.07	0.17	0.05	0.07	0	0	0.06	0.02	0
3C	0.1	0.1	0.05	0.36	0	0.38	0.01	0.05	0	0.05	0.05	0.01	0.07	0	0	0.01	0.01	0
4K	2.55	3.62	2.31	3.27	0.91	2.15	4.11	1.19	0	0	5.41	0	3.74	1.35	0.9	0	0.52	1.48
4С	0.22	0.43	0.32	0.69	0.01	0.35	0.33	0.17	0	0	0.32	0	0.09	0.05	0.01	0	0.06	0.16
5К	0.01	0.01	0.01	0	0	48.2	0.01	0.01	0	0	41.1	0	12.2	0	0	0	0	16.9
5С	0.3	0.4	0.6	0	0	0.35	0.05	0.2	0	0	0.11	0	0.11	0	0	0	0	0.01
6K	1.6	2.5	1.3	3.3	0.7	2.5	5.8	1.1	0.1	0.7	5.6	0.6	2.4	1.8	0.9	0.01	0.01	2.35
6С	1.6	2.3	1.4	0.6	0.05	0.17	0.06	0.14	0.25	0.4	0.25	0.13	0.09	0.06	0.03	0.35	0.11	0.05
7K	1.4	2	0.97	0.97	0	0.4	0.5	0.16	0.3	0.7	1.3	0.6	0.32	0.14	0.02	0.7	0.52	0.2
7С	0.25	0.2	0.1	0.55	0	0.4	0.4	0.13	0.01	0.01	0.35	0.01	0.1	0.17	0.02	0.01	0.05	0.2

Затем на основе "ковариационной матрицы" рассчитывается "матрица собственных векторов", каждый столбец которой является одной из компонент, наилучшим образом описывающих исходный массив данных. После чего определяется, какие из этих компонент являются "главными", т.е. вносят наибольший информационный вклад в описание анализируемых объектов. Для этого рассчитываются "собственные значения ковариационной матрицы" и определяется доля дисперсии каждой компоненты этой матрицы. После чего отбрасываются компоненты с наименьшей долей дисперсии. Оставляется столько "главных компонент", чтобы их общая доля дисперсии ("информационный вес") в упомянутой "ковариационной матрице" составляла 80–90%. Отброшенные же данные считаются малоинформативным "шумом". При этом алгоритм нормирует каждую из компонент, входящую в одну из "главных", а затем подбирает их веса таким образом, чтобы полученные "главные компоненты" имели наибольшую выборочную дисперсию и не коррелировали друг с другом, что помогает бороться с мультиколлинеарностью в анализируемом массиве данных. В результате анализа данным методом мы можем визуализировать полученные данные в "пространстве главных компонент" в виде точек, каждая из которых содержит информацию об отдельном молочном продукте — так что можно оценить состав и качество этого продукта в зависимости от его положения на графике [18, 19].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные, полученные в результате экспериментального исследования по описанной выше методике 7 образцов "свежих" и ускоренно "просроченных" промышленно выпускаемых разными производителями йогуртов с различными добавками, представлены в таблице. На рис. 2, 3 представлены образцы масс-спектров йогуртов № 1, 2 до и после их закисления. Как видно, в масс-спектрах фиксируется существенное возрастание (более чем на порядок) интенсивностей зарегистрированных пиков после закисления образцов, а также отчетливо проявляется существенное различие вида соответствующих масс-спектров (состава характерных пиков) для разных образцов, что позволяет формировать базу их фингерприн-тов.

Из представленных в таблице данных видно, что в большинстве случаев йогурты с ВН (образцы 4–7) демонстрировали на соответствующих масс-спектрах большее количество и бóльшую интенсивность пиков, нежели йогурты без ВН (образцы 1–3). Исключение составили "свежие" образцы 4 и 7, масс-спектры которых были сходны с масс-спектрами "свежих" йогуртов без ВН. Аналогично, в большинстве случаев большее количество и бóльшую интенсивность пиков в масс-спектрах демонстрировали "ускоренно ферментированные" йогурты.

Рис. 2. Образцы спектров йогуртов № 1.

1С — " свежие", 1К — ускоренно закисленные

Рис. 3. Образцы спектров йогуртов № 2.

2С — " свежие", 2К — ускоренно закисленные

При этом, все исследованные нами йогурты без ВН (образцы 1–3) на масс-спектрах в "свежем" виде демонстрировали мало- и среднеинтенсивные пики при m/z = 55, 56, 57, 58, 60, 64, 69, 70 и 72 Да. Кроме того, у "свежего" образца 1 имелся малоинтенсивный пик при m/z = 67 Да, а у образца 2 — пики средней интенсивности при m/z = 71 и 84 Да. При этом, по результатам наших предыдущих исследований, пики m/z = 58, 60 и 67 Да соответствовали, скорее всего, присутствию в исследуемых образцах ацетона, уксусной кислоты и изопрена. Тогда как пик при m/z = 69 Да, возможно, отражает присутствие в исследуемых образцах высоконенасыщенного углеводорода сквалена (С 30 Н 50 ), который благодаря своим значительным диетическим преимуществам широко используется в качестве вспомогательного вещества в различных фармацевтических препаратах.

В то же время при закислении образцов 1–3 большинство пиков на их масс-спектрах увеличивало свою интенсивность в 1.5–100 раз. Исключение составили пик при m/z = 60 у образца № 1, пики при m/z = 55, 57, 69 и 71 Да у образца 2, а также пики при m/z = 60 и 72 Да у образца 3, интенсивность которых при закислении образцов практически не менялась. Кроме того, при закислении образцов 1–3 на их масс-спектрах появлялись дополнительные пики при m/z = 61 Да (у образцов 2 и 3), 67 Да (у образца 2), 85 Да (у образца 1), 71 и 84 Да (у образцов 1 и 3), а также

73 и 88 Да (у образца 2). Причем наибольшее возрастание интенсивностей пиков в масс-спектрах демонстрировал при закислении образец 1.

В свою очередь, большинство исследованных нами йогуртов с ВН (образцы 4, 6 и 7) на масс-спектрах образцов в "свежем" виде демонстрировали среднеинтенсивные пики при тех же массовых числах, что и образцы йогуртов без ВН (m/z = = 55, 56, 57, 58, 60, 64, 70 и 72 Да), а также дополнительные пики при m/z = 61, 73, 85 и 88 Да. При закислении этих образцов на их масс-спектрах большинство пиков увеличивало свою интенсивность в 2–90 раз. Исключение составили пики при m/z = 55, 56, 57, 67 Да у образца 6 и пики при m/z = 57, 60, 61, 64, 73, 88 Да у образца 7 (интенсивность которых при закислении практически не менялась), а также пики при m/z = 67, 84, 85 Да у образца 6, интенсивность которых при закислении образца уменьшалась в 2.5–35 раз.

Кроме того, отдельного рассмотрения заслуживает образец 5. В масс-спектрах этого образца в "свежем" виде присутствовали те же пики, что и у остальных исследованных нами йогуртов с ВН в "свежем" виде, за исключением пиков при m/z = 58, 73, 85 и 88 Да. В то же время при закислении образца 5 интенсивность пиков на его масс-спектре при m/z = 60, 70, 72 и 88 Да увеличивалась в 120–1700 раз, тогда как интенсивность пиков при m/z = 55, 56, 57, 61 и 64 Да, наоборот, уменьшалась в 5–60 раз.

Рис. 4. Результат обработки массива данных, представленных в таблице, "методом главных компонент", где первая главная компонента (PC1) описывает 39.4% дисперсии, а вторая главная компонента (PC2) описывает 34% дисперсии.

Номера точек соответствуют номерам исследованных образцов.

Эллипсы доверительности: CE_K — 95% для закисленных образцов, CE_C — 95% для свежих образцов

МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ

Данные интенсивностей пиков, зарегистрированных в масс-спектрах исследованных образцов, содержащиеся в таблице, были обработаны с использованием компьютерной программы "Origin-Pro 2023" с помощью "метода главных компонент" (РСА), в котором для определения оптимального количества "главных компонент" использовался критерий "каменистой осыпи" (метод Кеттела).

В результате было получено:

PC1 = 0.66 ^× М 55 * + 0.63 ^× М 64 * + 0.39 ^× М 72 *,

PC2 = 0.72 ^× М 58 * – 0.28 ^× М 69 * – 0.22 ^× М 84 *,

М 55 * = М 55, i /(1/ n ^× Σ i М 55, i ) – 1,

М 58 * = М 58, i /(1/ n ^× Σ i М 58, i ) – 1,

М 64 * = М 64, i /(1/ n ^× Σ i М 64, i ) – 1,

М 69 * = М 69, i /(1/ n ^× Σ i М 69, i ) – 1,

М 72 * = М 72, i /(1/ n ^× Σ i М 72, i ) – 1,

М 84 * = М 84, i /(1/ n ^× Σ i М 84, i ) – 1, где

М 55, i , М 58, i , М 64, i , М 69, i , М 72, i , М 84, i — интенсивности пиков, зарегистрированных на масс-спектрах i -го образца, при m/z = 55, 58, 64, 69, 72 и 84 Да соответственно, а n = 7 — общее количество анализируемых образцов.

При этом, как видно на рис. 4, первая "главная компонента" (РС1) и (РС2) объясняли 73.4% исходных данных.

—УпаковкаN°2

—Упаковка Ns б

Рис. 5. Сравнение спектров, полученных для материалов, применявшихся производителями для упаковки различных промышленно выпускаемых йогуртов

Также по специально разработанной для этого методике анализировались масс-спектры материалов, применявшихся производителями для изготовления упаковок исследуемых образцов промышленной кисломолочной продукции. Результаты этого анализа на примере образцов № 2 (наименьшие выделения) и № 6 (наибольшие выделения) представлены на рис. 5, который демонстрирует существенное различие полученных масс-спектров. Из полученных данных видно, что масс-спектры испарений большинства упаковок, полученные по предложенной нами методике, были весьма сходны между собой и малоинтенсивны (несмотря на то, что, в отличие от остальных исследованных образцов, для изготовления упаковки образца № 2 вместо пластика типа "РЕТ 01" использовался пластик типа "C/PAP 81"). Но в то же время масс-спектры испарений упаковок образцов 3 и 6 демонстрировали пики, значительно бóльшие по интенсивности, чем у остальных исследованных образцов, при m/z = 60 Да (у образца 3) и m/z = 53, 54, 55, 56, 67, 69, 70, 83, 84, 85 и 86 Да (у образца 6), из которых наибольшими по интенсивности были пики при m/z = 55, 56 и 57 Да. Последнее может служить свидетельством того, что при изготовлении упаковок образцов 3 и 6 использовались пластики, хотя и той же марки "РЕТ 01", что и у большинства остальных исследованных образцов, но, возможно, вторично переработанные, либо с истекшим сроком хранения, либо изготавливавшиеся или хранившиеся с нарушениями технологического регламента. Это показывает, что представляемая нами методика может быть использована в том числе и для контроля качества материалов, используемых различными производителями для изготовления упаковок разной пищевой продукции.

ВЫВОДЫ

Таким образом, представленные результаты исследований образцов йогуртов, а также материалов для их упаковки показали, что разработанный нами подход, заключающийся в отборе испарений анализируемых образцов, регистрации их спектров с помощью газового квадрупольного масс-спектрометра с последующей "интеллектуальной" математической обработкой полученных данных методом многомерного статистического анализа данных, может быть использован в качестве эффективного метода контроля состава и качества молочной продукции (включая материалы, используемые для ее упаковки). При этом дополнительно разработанные нами методики предварительного "ускоренного ферментирования" анализируемых образцов молочной продукции, а также нагрева материалов, используемых производителями для упаковки этих образцов, перед пробо-отбором испарений существенно увеличивают чувствительность анализа.

Работа выполнена в Институте аналитического приборостроения Российской академии наук в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ № 075-01157-23-00