Возможности применения холодной атмосферной плазмы в онкологии (обзор литературы)

В последнее время большое внимание уделяется изучению влияния активных форм кислорода и азота (АФКиА) на появление опухолевых клеток, прогрессию опухоли и ее лечение. Механизм действия лучевой терапии и химиотерапии нередко опосредован генерацией АФКиА, действующих непосредственно на опухолевые клетки [1].

Плазма – частично ионизированный газ, содержащий ионы, электроны и незаряженные частицы (атомы, молекулы и радикалы) [2]. Плазма может быть двух типов: горячая и негорячая или низкотемпературная (холодная) атмосферная (НТП), которая в месте контакта имеет температуру ниже 104°F, т.е. комнатную температуру [2]. Для получения НТП используются различные газы (гелий, аргон, азот, смесь гелия и кислорода, воздух) [2, 3]. В зависимости от источника НТП состав и концентрация отдельных компонентов АФКиА различны [2–4].

Процессы ионизации, диссоциации, возбуждения и рекомбинации атомов и молекул в плазме приводят к образованию большого количества активных форм кислорода (АФК): атомарный кислород (О) [5, 6], гидроксил (ОН) [7], супероксид (О2-) [8], синглет-дельта кислород (1О2) [9] и пере- киси кислорода (Н2О2) [10], – и, в зависимости от используемого газа (газовой смеси) и геометрии плазмы, большого количества активных форм азота (АФА): атомарный азот (N) [11], оксид азота (NO) [12], периоксинитрит (ONOO-) [13] и других активных форм NOx-семейства. Известно, что лучевая и фотодинамическая терапия, используемые при противоопухолевом лечении, генерируют только АФК. Вместе с тем было показано, что высокие концентрации NO индуцируют апоптоз опухолевых клеток, предполагая, что азотзависимый стресс может быть одним из решающих факторов в противоопухолевой терапии [14].

Участие АФК в инициации и прогрессии опухоли [15] и их лечебный потенциал [16] внимательно изучаются долгие годы. Угроза малых количеств АФК хорошо переносится любой клеткой и нейтрализуется специальными ферментами, в том числе супероксиддисмутазой и каталазой [17]. Врожденная повышенная метаболическая активность в злокачественных клетках (эффект Варбурга) может представлять собой терапевтическую цель, поскольку опухолевые клетки по существу уже находятся на границе переносимости АФК по сравнению с нормальными клетками [1, 18]. Именно

поэтому в противоопухолевой терапии долгие годы используются различные методики, при которых генерируется большое количество АФК (лучевая и фотодинамическая терапия, некоторые химиопрепараты), что приводит к гибели злокачественных клеток [19–21]. Способность генерировать АФКиА [22] позволяет рассматривать холодную атмосферную плазму как весьма эффективного кандидата в состав противоопухолевой терапии.

Цель исследования – подытожить современные знания о механизмах биологического действия НТП на опухолевые клетки и представить возможные направления клинического применения НТП в составе противоопухолевого лечения.

Воздействие НТП на клетки и ткани – многофазный процесс, который начинается непосредственно при генерации плазмы, за которой следует фаза послесвечения плазмы, приводя к диффузному взаимодействию с жидкостьподобным слоем или окружением. Жидкую среду можно представить либо лечением культуры клеток в лабораторных экспериментах, либо физиологической жидкостью внутри и вокруг опухоли при клиническом применении НТП. Именно жидкая среда, модифицированная плазмой, влияет на клетки и ткани вокруг нее [23]. T. Murakami et al. [23] предложили глобальную модель, описывающую этот процесс, вовлекающий более 60 различных активных форм и около 1000 различных реакций. A.M. Hirst et al. [24] схематично представили этот процесс (рис. 1) с приблизительным временным масштабом для различных явлений в плазме и жидких фазах и последующее биологическое взаимодействие. Результаты дальнейших исследований [6, 11, 25–27] расшифровывают сложный химический процесс на границах газ – жидкость – ткань фаз, что позволяет точнее оценить механизм воздействия НТП на опухолевые клетки.

Биологическое действие НТП на опухолевые клетки исследовалось на различных клеточных линиях (табл. 1–2). M. Vandamme et al. [40] представили результаты одного из первых экспериментов по воздействию НТП на опухоль in vivo . Опухолевые клетки U87-Luc глиомы в количестве 4×10⁶ клеток в 0,1 мл физиологического раствора были подкожно введены самкам мышей (бестимусные голые мыши Balb/c и C57bl6 мыши). Лечение пульсами НТП (3 раза по 2 мин 100 Гц с интервалами 1 мин) в течение 5 дней было начато, как только опухолевый объем достиг размера 150 ± 50 мм³. Авторами показано, что через 24 ч после первого пульса у всех подопытных мышей было отмечено повышение биолюминесценции опухоли в 1,3 раза, что может свидетельствовать о повышении активности в опухолевых клетках вследствие эффекта реоксигенации, связанного с большим количеством АФК, что обычно наблюдается при действии малых доз облучения [56, 57]. Подобный эффект повышает чувствительность опухолевых клеток к дальнейшему воздействию, что и было отмечено через 5 дней лечения пульсами НТП, наблюдалось снижение интенсивности биолюминесценции на 54–88 %,

Рис. 1. Схематичное представление многофазного перехода генерированных НТП форм в биологический объект [24]. Показаны основные компоненты плазменной фазы, включая ионы, фотоны и нейтральные частицы, приводящие к генерации различных АФКиА по границе раздела плазма –жидкость и их продвижение и диффузия через произвольный слой биологической ткани. Справа представлены приблизительные временные рамки основных событий на границе плазма – жидкость и биологическое взаимодействие

Таблица 1

Доклиническое исследование биологического действия холодной атмосферной плазмы на опухолевые клетки

Опухоль некожной локализации Время воздействия Модель Исследуемые процессы Источник Лимфома 30–480 сек Клеточная линия моноцитарной лимфомы человека (U937) Метаболическая активность, жизнеспособность опухолевых клеток и апоптоз [28] Рак молочной железы 30, 60 и 120 сек Клеточная метастатическая линия (MDA-MB-231) Клеточная пролиферация и миграция [29] Рак яичников 2–600 сек Клеточная линия рака яичника (SKOV3 и HRA) Клеточная пролиферация и апоптоз [30] Рак толстой кишки 1 сек Клеточная линия рака толстой кишки Миграция и инвазия [31] Рак легких 10 сек Клеточная линия аденокарциномы легких человека (А549) Повреждение ДНК и жизнеспособность клеток [32] Рак печени 2 мин Клеточная линия рака печени человека (SK-HEP-1) Клеточная адгезия [33] Карцинома легких 20 сек Клетки карциномы легких мышей (TC-1) Апоптоз [34] Клеточная линия рака поджелу- Рак поджелудочной 5, 10 и 20 сек дочной железы (Colo-357 и PaTu8988T) Жизнеспособность клеток и [35] Мышиная клеточная линия апоптоз (6606DA) Плоскоклеточный рак некожной локализации 10, 30 и 45 сек Клеточные линии плоскоклеточного рака головы и шеи Жизнеспособность клеток и способность образовывать колонии [36] Жизнеспособность клеток, экс- 2–20 мин РС-3 клетки рака простаты прессия белков, количественное [37] Рак предстательной определение оксида азота железы 10 сек Клеточная линия эпителиального рака простаты человека (LNCaP Клеточная пролиферация и апоптоз [38] и PC-3) Глиома – Клеточная линия глиомы человека (U373MG) Жизнеспособность клеток [39] 20 сек в сут 3 дня U87-Luc глиобластома на бести-мусных BALB/c голых и C57bl6 мышах Температура и противоопухолевый эффект [40] 30, 60 и 120 Клеточная линия глиобластомы Жизнеспособность клеток, по- [41] сек человека вреждение ДНК и клеточный цикл Глиобластома 60–180 сек Клеточная линия глиобластомы человека (U87) Жизнеспособность клеток, клеточный цикл и апоптоз [42, 43] 30, 60, 90 и 180 сек Клеточные линии глиомы (U87, U373, A172), нормальные астроциты человека Е6/Е7 и эндотелиальные клетки пупочной вены Жизнеспособность клеток, клеточный цикл и апоптоз [44] человека (HUVEC) Нейробластома 0, 30, 60 и 120 сек Neuro2a клетки нейробластомы мышей Метаболическая активность и апоптоз [45] что сопровождалось уменьшением объема опухоли на 33 %, при этом каких-либо изменений здоровых тканей отмечено не было. Достаточное количество исследований как in vitro, так и in vivo проведено по изучению действия НТП на меланому [49, 58–65]. Благодаря этим исследованиям удалось детализировать модель апоптотической гибели опухолевых клеток (рис. 2) за счет апоптоза через активацию сигнальных путей TNF-ASK1, ATM/p53, MAPK [27, 36, 37, 43, 46, 54].

Было зарегистрировано, что АФК генерируются в клетках, подверженных стрессовым состояниям, таким как гипоксия, воздействие химических веществ, УФ-излучения и т. д., которые вызывают повреждение внутриклеточных органелл и мембран, белков, ДНК и липидов, что приводит к гибели

Таблица 2

Механизмы гибели опухолевых клеток под действием холодной атмосферной плазмы

Клеточная линия	Среда	Длительность воздействия	Механизм гибели клеток	Источник
Клеточные линии рака простаты (PC-3 и LNCaP)	Суспензия, объем 500 мкл	10 сек	Апоптоз	[38]
Клеточные линии глиомы (U87, U373, A172)	Адгезированные клетки, 96-лунковая плашка, ~40 % слияния	До 180 сек	Апоптоз / некроз	[44]
Клеточная линия лимфомы (U937)	Адгезированные клетки, плашки 10 см, объем 5 мл	До 480 сек	Апоптоз	[28]
Злокачественные клеточные линии различного происхожде-	Адгезированные клетки, плашки	30–60 сек, до 10 повторяющихся	Апоптоз	[12]
ния		воздействий
Клеточные линии колорек-	Адгезированные клетки в различ-
тального рака (Caco2,HCT116,	ных многолуночных культураль-	До 30 сек	Апоптоз	[47]
SW480, HT29)	ных плашках
Клеточные линии глиомы и колоректального рака (U87MG-	Адгезированные клетки, 24-лунковая плашка, объем 500 мкл	До 30 сек	Апоптоз
Luc2, HCT-116-Luc2)		6 мин ежедневно,		[48]
Ксенографт глиомы (U87MG-Luc2)	Подкожная опухоль	последовательно в течение 5 дней	Апоптоз
Клеточные линии рака головы и шеи (FaDu, SNU1041, SNU899, HN9)	Суспензия, плашки 6 см, объем 3 мл	1 сек при 2 кВ или 4 кВ 20 сек ежедневно,	Апоптоз	[8]
Ксенографт FaDu	Подкожная опухоль	последовательно в течение 20 дней	Апоптоз
Различные клеточные линии меланомы	Адгезированные клетки, различные культуральные плашки без культуральной среды	До 120 сек	Физиологическое старение, апоптоз	[49, 58–65]
Первичные эпителиальные клетки рака предстательной	Суспензия, объем 1,5 мл	До 600 сек	Некроз, аутофагия	[10]
железы

клеток путем апоптоза. В последних работах были изучены различные механизмы действия CAP в раковых клетках, которые включают: активацию генов белка p53 [66] и р21 CDK ингибитора [67], арест клеточного цикла в фазах G2/M и S [68], опосредованный АФК арест клеточного цикла [48] и апоптоз вследствие дисфункции митохондрий [69, 70]. K. Panngom et al. [71] продемонстрировали снижение активности митохондриальных ферментов и мембранного потенциала митохондрий в опухолевых клетках после воздействия на них НТП. Кроме того, экспериментально было доказано, что НТП может контролировать внутриклеточное содержание АФКиА и перекисей [72]. Основные пути передачи клеточных сигналов и функции белков могут быть нарушены или полностью повреждены в результате сильного и продолжительного нарушения окислительно-восстановительных сигналов под действием НТП [73].

В целом противоопухолевые механизмы воздействия НТП различны: повреждение ДНК вследствие внутриклеточного накопления АФКиА [46, 50, 74, 75], снижение жизнеспособности и клоногенности клеток [51, 52], снижение пролиферации [38], арест клеточного цикла [53, 54, 76], феномен естественного старения клеток [55] и не-апоптотическая гибель опухолевых клеток [52], причем с дозозависимым эффектом. Ключевыми молекулами противоопухолевого эффекта НТП оказались Н2О2 и NO [77].

Многими исследователями было показано, что растворы, подвергшиеся воздействию НТП, способны оказывать сходное с прямым воздействием НТП действие на опухолевые клетки [78–81]. H. Tanaka et al. исследовали действие обработанного НТП раствора Рингера с лактатом на клеточные линии U251SP клетки (клеточная линия глиобластомы человека), MCF10A клетки (клеточная линия эпителиальных клеток грудной железы человека), SiHa клетки (клеточная линия рака шейки матки человека), SK-OV-3 клетки (клеточная линия рака яичников человека) и клеточную линию

Рис. 2. Модель индукции холодной атмосферной плазмы апоптоза опухолевых клеток [65]. Индуцированная НТП продукция АФК и активация сигнального пути TNF за счет прямого или непрямого взаимодействия клеток, которые приводят к активации сигнального пути ASK1, далее стимуляции p38α MAPK или JNK для последующей индукции Caspase-3/7-зависимого апоптоза опухолевых клеток человеческих кератиноцитов новорожденного [80]. Исследования показали, что облучение НТП L-лактата, входящего в состав раствора, приводит к образованию большого количества Н2О2, что и обеспечивает противоопухолевый эффект как в культуре клеток, так и в эксперименте на модели ксенографных мышей. Вместе с тем под действием НТП из лактата образуются группы, подобные уксусной и пировиноградной кислотам, которые также обладают выраженным противоопухолевым эффектом. Авторы продемонстрировали различную чувствительность опухолевых клеток к обработанному НТП раствору [80].