Возможности типирования рака молочной железы с использованием методики ОТ-ПЦР

В 2017 г. по данным статистического анализа 64,5 % больных в Российской Федерации проводилось комбинированное лечение по поводу рака молочной железы (РМЖ) [1]. Наряду с хирургическим и лучевым методами одним из основных способов лечения данной категории пациентов остается адъювантная системная терапия, выбор которой на данный момент, согласно отечественным и международным рекомендациям, определяется молекулярно-генетическими подтипами опухоли, к которым относятся люминальный тип А, люминальный тип В (HER2-отрицательный), люминальный тип В (HER2-положительный), HER2-положительный и трижды негативные опухоли [2, 3]. По современным представлениям, для этой цели с помощью стандартного иммуногистохимического (ИГХ) метода оцениваются рецепторный статус (рецепторы эстрогенов и прогестерона, рецептор эпидермального фактора роста HER2-neu), а также маркер клеточной пролиферации Ki67, определяемые иммуногистохимическим исследованием ткани основного опухолевого узла и пораженных лимфатических узлов [4–6].

Однако, несмотря на широкое клиническое распространение, данное распределение характеризуется рядом ограничений и высокой вероятностью неточностей в постановке правильного диагноза, что в большей степени обусловлено возможными нарушениями методологии выполнения и интерпретации исследования, а также неточностью полученных результатов [7–9]. Этот факт подтверждают результаты ряда исследований, по данным которых только 73 % злокачественных опухолей молочной железы с наличием экспрессии рецептора эстрогена относятся к люминальным А и В подтипам [10]. Неоднозначным до сих пор остается отношение к маркеру клеточной пролиферации Ki67, определяемому методом ИГХ и являющимся ключевым критерием в типировании люминальных А и В подтипов РМЖ. Так, в 2013 г. по рекомендациям St.Gallen необоснованным было признано само пограничное значение уровня Ki67, а в 2015 г. серьезному обсуждению подверглась информативность значения Ki67, равного 20 % [11, 12].

В последнее время все большее внимание отводится панелям на основе экспрессии генов, однако они в большей степени свидетельствуют о риске прогрессирования заболевания и в меньшей говорят о чувствительности опухоли к проводимому лечению [13]. Применяемая в настоящее время панель Prosigna информативна в отношении возможности идентификации подтипов РМЖ, при этом ее существенным недостатком является сложность статистической обработки полученных данных, что существенно ограничивает ее использование в клинической практике [14].

Все вышесказанное обусловливает необходимость разработки и внедрения новых методов фенотипирования РМЖ, что позволит существенно повысить чувствительность и специфичность исследования по сравнению с использованием классической ИГХ модели [15, 16]. В частности, в настоящее время на базе ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» (РНЦРР) разработана отечественная мультигенная модель, определяемая методом ПЦР, с включением генов, отвечающих за основные механизмы жизнедеятельности опухолевой клетки: клеточную пролиферацию, апоптоз, клеточную дифференцировку и межклеточное взаимодействие [17, 18].

Целью исследования явилось изучение диагностической возможности типирования рака молочной железы с использованием отечественной панели, включающей определение 24 генов методом ОТ-ПЦР, и сравнение полученных результатов с данными иммуногистохимического анализа.

Таблица 1

Молекулярно-биологические подтипы рака молочной железы (RUSSCO 2018)

Молекулярно-биологический подтип	Клинико-патологическое (суррогатное) определение подтипа
Люминальный А	Наличие всех факторов: РЭ положительный РП высокий (>20 %) HER2/neu-отрицательный Ki67 низкий (<20 %)
Люминальный В (HER2-отрицательный)	РЭ положительный HER2/neu-отрицательный и наличие одного из следующих факторов: РП низкий (<20 %) Ki67 высокий (>30 %)
Люминальный В (HER2-положительный)	РЭ положительный HER2/neu-положительный РП любые Ki67 любой
HER2-позитивный (не люминальный)	HER2/neu-положительный РЭ и РП-отрицательные

Базальноподобный рак                            РЭ, РП, HER2/neu-отрицательные

(тройной негативный протоковый)

Материал и методы

В исследование были включены 199 больных раком молочной железы (T1–3N0–3M0), получавшие лечение на базе хирургического отделения ФГБУ «Российский научный центр рентгенора-диологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации с 2013 по 2017 г. Всем больным проводилось морфологическое и иммуногистохимическое исследование операционного материала по стандартной методике с определением гистологического типа опухоли, степени ее злокачественности, рецепторного статуса (экспрессия эстрогена, прогестерона и эпидермального фактора роста HER2/neu), а также маркера клеточной пролиферации Ki67.

Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2012). Оценка степени злокачественности опухоли выполнялась в соответствии с критериями Elston-Ellis. При проведении ИГХ-исследования применялись: антитела PA0151, клон 6F11, Leica Microsystems (для определения экспрессии рецепторов эстрогена), PA0312, клон 16, Leica Microsystems (для определения экспрессии рецепторов прогестерона), А0485, Dako, Дания (для определения рецептора эпидермального фактора роста HER2/neu) и PA0118, клон MM1, Leica Microsystems (для маркера клеточной пролиферации Ki67).

Пролиферативная активность определялась в ядрах опухолевых клеток, экспрессирующих Ki67. Оценка экспрессии рецепторов к половым гормонам выполнялась полуколичественным способом по D.C. Alldred: подсчету подвергалась только ядерная реакция. Положительная экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона оценивалась при суммарном количестве баллов более 3. Оценка экспрессии рецептора эпидермального фактора роста HER2/neu выполнялась согласно рекомендациям Wolff et al. с учетом только инвазивного компонента опухоли. В сомнительных случаях (категории HER2 2+) проводился FISH-анализ (флуоресцентная гибридизация in situ) по стандартной методике. По результатам иммуногистохимического анализа производилось распределение больных РМЖ на молекулярнобиологические подтипы согласно рекомендациям RUSSCO от 2018 г. (табл. 1).

Молекулярно-генетическое исследование с использованием метода ОТ-ПЦР проводилось в научно-исследовательском отделе молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России. Выполнялось изучение свежеполученного операционного материала основного опухолевого узла и удаленной аксиллярной клетчатки в несколько этапов: выделение мРНК из полученной ткани, реакция ОТ-ПЦР и непосредственно проведение ПЦР в режиме реального времени.

На этапе выделения РНК использовались коммерческие наборы RNeasy производства Qiagen

Таблица 2 распределение больных раком молочной железы на молекулярные подтипы на основании данных ИГх исследования

Критерий оценки	Количество больных (n=199)
Люминальный тип А	59 (30 %)
Люминальный В (HER2-негативный)	52 (26 %)
Люминальный В (HER2-позитивный)	19 (9 %)
Трижды негативный рак	28 (14 %)
HER2-позитивный рак	41 (21 %)

Таблица 3

результаты кластерного анализа по распределению экспрессии 24 генов в соответствии с молекулярными подтипами рМЖ

Подтип РМЖ	Люм. А	Люм. В HER2-		Люм. В HER2+	HER2+	ТНР
Люм. А	0,00000	5,64342		2,64256	2,42323	1,76574
Люм. В HER2-	2,23421	0,00000		4,06545	2,87632	4,16567
Люм. В HER2+	1,37232	2,02563		0,00000	1,54334	1,98234
HER2+	1,48673	1,43567		1,23432	0,00000	1,34534
ТНР	1,13345	2,00645		1,54232	1,32423	0,000000
						Таблица 4
Данные дискриминантного анализа по 24 исследованным генам, разделенным на 5 групп
	%	G_1:1	G_2:2	G_3:3	G_4:4	G_5:5
G_1:1	88,6364	39	1	2	0	2
G_2:2	95,1220	0	39	1	0	1
G_3:3	100,0000	0	0	117	0	0
G_4:4	81,8182	0	0	4	36	4
G_5:5	93,4783	0	0	5	1	86
Всего	93,7870	39	40	129	37	93

USA. Обработка исследуемого материала проводилась в соответствии с протоколом компании-производителя. Объем конечного раствора составлял 60 мкл со средней концентрацией РНК в нем 35–40 мкг/мл. После получения РНК немедленно проводился этап обратной транскрипции, для чего использовали реактивы фирмы «НПФ ДНК-Технология». Реакции амплификации генов ставили в разных пробирках в двух повторах. Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл – 80 ºС 30 сек, 94 ºС 1 мин; 50 циклов – 94 ºС 10 сек, 64 ºС 20 сек, использовали приборы «ДТ-322» и «ДТ-964» производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64 ºС.

Исследуемая панель генов включала 24 гена (21 функциональный и 3 контрольных гена), которые были разделены в различные функциональные группы, позволяющие оценить основные биологические характеристики опухолевых клеток: контроль пролиферации ( KI67, CCND1, MYC, P16^ink4A, PTEN, MYBL2, STK15, CCNB1 ), контроль апоптоза ( BIRC5, TERT, BCL2, BAG1, NDRG1 ), клеточная дифференцировка/рецепторы ( ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1 ), клеточная адгезия ( MMP11, CTSL2 ), маркер активированных макрофагов (CD68) и контрольные гены ( B2M, GUSB, HPRT1 ).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Statistica 10.0.4 for Windows. Для изучения полученных результатов применялись параметрический и непараметрический анализ, а также кластерный и дискриминантный анализ. Различие считалось достоверным при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По данным проведенного иммуногистохимического исследования были выделены 5 молекулярных подтипов рака молочной железы (табл. 2): люминальный тип А встречался у 59 (30 %) больных; люминальный В (HER2-негативный) – у 52 (26 %); люминальный В (HER2-позитивный) – у 19 (9 %); трижды негативный – у 28 (14 %); HER2-позитивный – у 41 (21 %) пациента.

Принимая во внимание недостаточность данных при применении стандартного иммуногистохимического анализа у больных раком молочной железы, нами была проанализирована возможность использования панели, состоящей из 24 генов ( Ki67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68, GUSB, HPRT1, B2M ), определяемых методом ОТ-ПЦР. При этом на первом этапе статистической обработки использовался метод К-средних (кластерный анализ), для чего проводилось сопоставление экспрессии 24 исследуемых генов с 5 выделенными группами, соответствующими молекулярно-биологическим подтипам, указанным в клинических рекомендациях, и определение среднего значения уровня экспрессии (табл. 3).

Таблица 5

Ген	λ Уилкса	Частная λ	F-включит.	р	Толер.	1-толер. (R-кв.)
lnKI67	0,031768	0,993242	0,53240	0,712	0,719036	0,280964
lnSTK15	0,032876	0,959749	3,28170	0,011	0,608173	0,391827
lnCCNB1	0,031845	0,990830	0,72422	0,575	0,627925	0,372075
lnCCND1	0,032451	0,972333	2,22659	0,066	0,712822	0,287178
lnMYC	0,032753	0,963373	2,97501	0,019	0,680500	0,319500
lnMYBL2	0,032649	0,966429	2,71816	0,029	0,533874	0,466126
lnP16INK4a	0,032320	0,976276	1,90155	0,109	0,850018	0,149982
lnPTEN	0,032377	0,974546	2,04377	0,088	0,817666	0,182334
lnBIRC5	0,033576	0,939761	5,01582	0,000	0,712487	0,287513
lnBCL2	0,032749	0,963477	2,96628	0,019	0,689965	0,310036
lnBAG1	0,031809	0,991969	0,63355	0,638	0,746579	0,253421
lnESR1	0,036973	0,853418	13,44018	0,000	0,639076	0,360924
lnPGR	0,033729	0,935499	5,39517	0,000	0,788054	0,211946
lnHER2	0,033807	0,933322	5,59031	0,000	0,633044	0,366956
lnGRB7	0,034152	0,923911	6,44431	0,000	0,749497	0,250503
lnMGB1	0,048828	0,646211	42,84053	0,000	0,871980	0,128020
lnMMP11	0,039561	0,797583	19,85892	0,000	0,818982	0,181018
lnCTSL2	0,031819	0,991652	0,65871	0,621	0,716590	0,283410
lnCD68	0,032084	0,983451	1,31677	0,263	0,766683	0,233317
lnTERT	0,070631	0,446735	96,90978	0,000	0,927349	0,072651
lnNDRG1	0,032346	0,975502	1,96514	0,099	0,862804	0,137196

Таблица 6

Подтип РМЖ	%	Люм. А (ИГХ)	Люм. В HER2-(ИГХ)	Люм. В HER2+ (ИГХ)	HER2+ (ИГХ)	ТНР (ИГХ)
Люм. А (ОТ-ПЦР)	62,5	15,0	5,0	3,0	1,0	0,0
Люм. В HER2- (ОТ-ПЦР)	56,5	9,0	13,0	1,0	0,0	0,0
Люм. В HER2+ (ОТ-ПЦР)	53,3	4,0	3,0	8,0	0,0	0,0
HER2+ (ОТ-ПЦР)	88,9	0,0	1,0	0,0	8,0	0,0
ТНР (ОТ-ПЦР)	60,0	1,0	1,0	1,0	1,0	6,0
Всего	61,7	29,0	23,0	13,0	10,0	6,0

Значимость исследуемых 24 генов по результатам канонического анализа

Сопоставление результатов типирования рака молочной железы с использованием ИГх и ОТ-ПЦр исследований

Применялся дискриминантный анализ, продемонстрировавший высокие показатели точности распределения образцов опухолевой ткани к заданным ранее подгруппам (суммарный процент классификаций 93,8). Наиболее высокие показатели отмечались для групп 2 и 3 (95 и 100 % соответственно); меньшие – в подгруппе 4 (81 %) (табл. 4).

При этом наиболее значимыми генами в распределении на подтипы рака молочной железы являлись гены, отвечающие за контроль пролиферации – STK15, MYC, MYBL2; контроль апоптоза – BIRCC5, BCL2, TERT; дифференцировку/ рецепторный статус: ESRP1, PGR, HER2, GBR7, MGB1, MMP11 (табл. 5). Обращает на себя внимание тот факт, что маркер клеточной пролиферации Ki67, играющий одну из ключевых ролей в типи-ровании люминальных подтипов рака молочной железы, не вносит значимого вклада в дифферен- цирующую модель, что свидетельствует о том, что его использование для разделения подтипов нецелесообразно.

На основании проведенных исследований проводился сравнительный анализ результатов распределения рака молочной железы на подтипы, определяемые методами ИГХ и ОТ-ПЦР, по результатам которого суммарный процент совпадений составил 61,7 %. При этом большие показатели соответствия отмечались в подгруппе с HER2-позитивным раком молочной железы – 88,9 %, что, вероятно, обусловлено проведением дополнительных методов диагностики (методы гибридизации in situ) в случаях сомнительной экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (2+) (табл. 6).