Возникновение диплоидных растений в диплоидно-тетраплоидных скрещиваниях у кукурузы (Zea mays L.): анализ плоидности эндосперма выполненных зерновок

Апомиксис — способ семенного размножения покрытосеменных растений, при котором зародыш развивается из неоплодотворенной яйцеклетки, приковывает внимание генетиков и селекционеров растений уже более 100 лет. Интенсивные исследования апомиктичного способа размножения связаны с надеждами на возможность его использования для закрепления гетерозиса гибридов F 1 и их клонального размножения семенами (13). Апомиксис достаточно широко распространен в дикой флоре, преимущественно у полиплоидных видов, и редко встречается у культурных растений. В этой связи высказывалось мнение о принципиальной невозможности создания линий и гибридов диплоидных культурных растений с наследуемой способностью к апомиктичному размножению (4). Однако недавние публикации результатов экспериментов исследовательских групп из Франции и Китая, в которых сообщалось о создании гибридов F 1 риса, способных к апомиктичному размножению, на основе использования технологии геномного редактирования, свидетельствуют о достижимости решения этой задачи (5-8).

Один из ключевых факторов формирования апомиктичных семян — способность к образованию нередуцированных зародышевых мешков (ЗМ), диплоспорических, возникающих в результате нарушений мейоза, либо апоспорических, развивающихся из соматических клеток, расположенных вблизи мейотического ЗМ (1, 2). Эффективным подходом для выявления способности к формированию нередуцированных ЗМ у диплоидных растений, в частности у кукурузы, может служить использование тетраплоидных опылителей. Известно, что у кукурузы скрещивания $ 2 n х ^ 4 n чаще всего приводят к формированию щуплых зерновок вследствие нарушения баланса материнского (м) и отцовского (о) геномов 2м:1о в эндосперме, который в таких скрещиваниях имеет геномный баланс 2м:2о из-за слияния двух гаплоидных полярных ядер с диплоидным спермием (9-12). Однако в экспериментах, проведенных нами ранее, при опылении диплоидной линии кукурузы АТ, способной к гаплоидному партеногенезу (13), а также ее гибридов, пыльцой разных тетраплоидных линий, в некоторых случаях на початках формировались крупные выполненные зерновки, из которых развивались диплоидные матроклинные растения и тетраплоидные гибриды (14). На основании этих фактов было высказано предположение, что выполненные зерновки могли возникать вследствие оплодотворения нередуцированных ЗМ диплоидными спермиями, поскольку в таких случаях эндосперм развивается в результате слияния двух диплоидных полярных ядер с диплоидным спермием, в результате чего образуется гексаплоидный эндосперм и восстанавливается баланс материнского и отцовского геномов 2м:1о (14, 15).

Для проверки этой гипотезы мы провели генотипирование диплоидных «матроклинных» растений, развивающихся из выполненных зерновок, 828

с помощью SSR- и InDel-маркеров. Полученные результаты свидетельствовали в пользу гипотезы о возникновении таких растений на основе оплодотворения нередуцированных яйцеклеток диплоидными спермиями и последующей элиминации хромосом одного из родительских компонентов (преимущественно тетраплоидного опылителя) (16). Некоторые растения по совокупности фенотипических признаков, практически, полностью соответствовали материнской линии (АТ ГПЛ), однако на одной-двух хромосомах присутствовали маркеры отцовской линии.

Нами впервые с помощью проточной цитометрии получены экспериментальные доказательства, свидетельствующие, что развитие выполненных зерновок у кукурузы в скрещиваниях 2 n х 4 n происходит на основе оплодотворения нередуцированных зародышевых мешков, формирующихся у материнских линий. Такая гексаплоидная природа эндосперма у выполненных зерновок, развивающихся в скрещиваниях 2 n х 4 n , подкрепляет балансовую теорию развития эндосперма прямыми экспериментальными доказательствами.

Нашей целью стала дальнейшая проверка гипотезы о возникновении выполненных зерновок в гетероплоидных скрещиваниях 2 n * 4 n на основе нередуцированных зародышевых мешков, образующихся у материнских линий, посредством анализа плоидности эндосперма таких зерновок с помощью проточной цитометрии.

Методика. В работе использовали выполненные зерновки, развившиеся на початках диплоидных линий кукурузы: АТ ГПЛ (2 n ), обладающей способностью к гаплоидному партеногенезу, 18-10-4 (2 n ), В47 (2 n ), КМ (2 n ), Краснодарская 2 (2 n ), Краснодарская 9 (2 n ), Краснодарская 22 (2 n ), а также гибридов F 1 и F 3 (B47/AT ГПЛ) (2 n ), F 1 (КМ1/Сахарная1) (2 n ) и F 1 (КМ/АТ ГПЛ) (2 n ), которые были опылены пыльцой тетраплоидных линий Тетра-Парий (ТП) (4 n ), Краснодарский тетраплоид (КрТ) (4 n ) и Черная Тетра (ЧТ) (4 n ). Скрещивания были проведены в 2022 году. Растения выращивали на опытном участке Селекционного комплекса ФАНЦ Юго-Востока (г. Саратов), пространственно изолированном от других посевов кукурузы с целью исключения случайного опыления. У всех растений для предотвращения неконтролируемого опыления до начала цветения удаляли метелки и изолировали початки пергаментными изоляторами. При проведении скрещиваний пыльцу с метелки каждого тетраплоидного растения стряхивали в индивидуальный чистый изолятор и наносили на рыльца початка диплоидного материнского растения.

На 18-е сут после опыления с початков диплоидных линий собирали крупные выполненные зерновки, которые примерно в 2 раза и более превосходили по объему другие зерновки, завязавшиеся на том же початке. Зерновки стерилизовали 70 % этиловым спиртом (30 с) и 0,1 % раствором сулемы (15 мин). После 3-кратной промывки автоклавированной водой в стерильных условиях отделяли эндосперм и фиксировали его в смеси спирта (95 %) и пропионовой кислоты (3:1) в течение 3 ч, отмывали 3кратно в 70 % спирте и оставляли в нем на хранение при температуре - 20 ° C для последующего исследования плоидности с помощью проточной цитометрии, а зародыш помещали в пробирки на питательную агаризованную среду MS.

Зародыши выращивали в растильной комнате, оборудованной лампами Fluora L 36w/77 («Osram Licht AG», Германия) (фотопериод 16 ч день/8 ч ночь; 26±1 °C). Проростки с развитыми корнями переносили на несколько суток в пробирки с водой для адаптации к нестерильным условиям, после чего высаживали в теплицу в пластиковые сосуды и затем — на делянку экспериментального поля Селекционного центра ФАНЦ Юго-Востока. Агроклиматические условия соответствовали росту и развитию растений кукурузы в полевых условиях и способствовали получению семян.

Для определения плоидности кончики корешков растений, выращенных в пластиковых сосудах, фиксировали в ацетоалкоголе (1:3) (14). Фиксацию проводили на 12-е-14-е сут после высаживания в землю в 10-11 ч утра при 26-28 ° С. Перед фиксацией кончики корешков помещали на 3 ч в насыщенный раствор а -бром-нафталина для укорачивания хромосом. Кончики корешков проводили через серию растворов в следующей последовательности: 3,6 % (1N) HCl (10 мин), 50 % HCl (20 мин), дистиллированная вода (1-2 мин), 45 % уксусная кислота (20 мин). Затем окрашивали в 4 % ацетогематоксилине (30-60 мин). Препараты анализировали с помощью светового микроскопа AxioScope A1 («Zeiss», Германия) и фотографировали с помощью цифровой камеры MrC («Zeiss», Германия) при увеличении 1000½. Для каждого растения плоидность определяли на основании анализа 8-10 метафазных пластинок.

Для проведения проточной цитометрии эндосперм измельчали лезвием в течение 1,5-2 мин в пластиковой чашке Петри на льду в 2 мл охлажденного буфера Голбрайта (45 мМ MgCl 2 , 30 мM цитрата натрия, 20 мM МОРS, 1 мг/мл Triton X-100, pH 7,0) (17), фильтровали через фильтр с диаметром пор 50 мкм и центрифугировали (5418 R, «Eppendorf», Германия) в течение 2 мин при 100 g и 4 ° С. Супернатант сливали, а осадок с ядрами ресуспендировали в 1 мл буфера с добавлением DAPI (4 мкг/мл) и РНКазы (50 мкг/мл). Окрашивали 10 мин на льду в темноте, встряхивали и центрифугировали на вортексе (2 с) (Microspin FV-2400, «Biosan», Латвия) для осаждения крахмала, после чего надосадочную жидкость переносили в другую пробирку и анализировали на флуороцитометре BD FAC SCANTO II («BD Bioscience», Германия) в Институте биохимии и генетики УФИЦ РАН (г. Уфа) при FSC-300, SSC-280, Pacific Blue-A ( X = 250 нм). В качестве стандартов использовали ядра из листа гаплоидного растения линии АТ ГПЛ и из эндоспермов зерновок АТ ГПЛ и тетраплоидной линии Черная Тетра. В этих экспериментах исследовали выполненные зерновки из следующих комбинаций скрещиваний: F 3 (B47/AT ГПЛ)(2 n ) х ТП(4 n ), F 1 (КМ/Сахар-ная1)(2 n ) х КрТ(4 n ), АТ ГПЛ(2 n ) х КрТ(4 n ), В47(2 n ) х ТП(4 n ). В каждом образце учитывали по 2,5-3 тыс. ядер. Анализировали только экспериментальные данные, в которых величина ошибки каждого пика не превышала 5 %.

Статистическую обработку данных проводили посредством сравнения долей по методу Фишера, применяющемуся для малых, а также неравновеликих выборок (18). Обработку результатов проточной цитофотометрии осуществляли при помощи программного обеспечения FSC-Express, v.7.

Результаты. Для получения выполненных зерновок с целью последующего анализа плоидности их эндосперма были проведены опыления ряда диплоидных линий и гибридов пыльцой тетраплоидных линий Тетра-Парий, КрТ и Черная Тетра. В этих скрещиваниях в большинстве случаев формировались щуплые зерновки с неразвитым эндоспермом, что следовало ожидать, учитывая тетраплоидную природу эндосперма таких зерновок, геномный баланс которых соответствовал соотношению 2м:2о. Однако, наряду с зерновками со щуплым эндоспермом, на некоторых початках изредка развивались зерновки с полностью или частично выполненным эндоспермом (рис. 1).

Рис. 1. Щуплые (белые стрелки) и выполненные (черные стрелки) зерновки кукурузы ( Zea mays L.), завязавшиеся на початках диплоидных (2 n ) растений F 1 (В47/АТ ГПЛ) (a) и F 3 (В47/АТ ГПЛ) (б, в) , опыленных пыльцой тетраплоидных (4 n ) линий Краснодарский Тетраплоид (а) и Черная Тетра (б, в) (г. Саратов, 2022 год) .

1. Частота выполненных зерновок, завязавшихся на початке диплоидных линий и гибридов кукурузы (Zea mays L.) при их опылении пыльцой от тетраплоид-ных линий (г. Саратов, 2022 год)

Линия, гибрид (2 n )	Опылитель (4 n )	Число опыленных початков, шт.		Число зерновок на початках с выполненными зерновками, шт.				Частота выполненных зерновок, %
		всего	с выполнен ными зерновками, шт. (%)	всего	уплых	частично выполненных	выпол ненных
АТ ГПЛ	ЧТ	9	3 (33,3)	238	231	4	3	1,2 (0,7-3,0)1
	КрТ	21	2 (9,5)	120	11	5	4	3,3 (2,7-9,0)
КМ	КрТ	17	2 (11,7)	91	37	52	2	2,1 (1,6-1,9)
В47	ТП	4	1 (25,0)	34	33	2	2	5,8 (5,8)
Краснодарская 2	КрТ	18	3 (16,6)	312	307	0	5	1,6 (0,5-100)
Краснодарская 9	КрТ	16	4 (25,0)	306	275	20	11	4,1 (1,5-7,5)
Краснодарская 22	ЧТ	9	2 (22,2)	441	414	19	8	1,8 (1,7-1,8)
	КрТ	10	2 (20,0)	10	4	4	2	20,0 (20-100)
18-10-4	ТП	4	3 (75,0)	235	150	73	12	5,1 (1,6-8,3)
	ЧТ	6	1 (16,6)	43	40	2	1	2,3 (2,3)
F 1 (КМ/АТ ГПЛ)	ТП	6	2 (33,3)	167	131	22	14	8,3 (5,8-11,1)
	ЧТ	7	1 (14,2)	37	33	3	1	2,7 (2,7)
	КрТ	26	1 (3,8)	308	300	5	3	0,9 (0,9)
F 1 (В47/АТ ГПЛ)	ЧТ	4	2 (50,0)	126	117	4	5	4,0 (1,8-5,5)
	КрТ	3	2 (66,6)	68	61	3	4	5,9 (1,8-2,3)
F 3 (В47/АТ ГПЛ)	КрТ	41	3 (7,3)	980	929	44	7	0,7 (0,2-2,2)
	ЧТ	20	3 (15,0)	377	363	8	6	1,5 (0,5-12,9)
	ТП	7	3 (42,8)	378	264	102	12	3,2 (0,8-8,5)
F 1 (КМ1/Сахарная 1)	ЧТ	7	3 (42,8)	48	7	0	41	85,4 (33,3-100,0)
	КрТ	14	8 (57,1)	436	329	90	17	3,9 (1, 9-37,5)
Всего	КрТ	166	27 (16,3)	2631	2353	223	55	2,1
	ЧТ	62	15 (24,2)	1309	1204	40	65	5,0***
	ТП	17	8 (47,1)*, **	780	545	197	38	4,9***
Примечание.	1 — в скобках указано варьирование на отдельных початках. КМ —						Коричневый Маркер,

ЧТ — Черная Тетра, КрТ — Краснодарский Тетраплоид, ТП — Тетра Парий. Линия 18-10-4 была создана на основе диплоидного растения, полученного из выполненной зерновки, завязавшейся в скрещивании КМ ½ ЧТ.

* и ** p < 0,05 и p < 0,01 соответственно по сравнению с ЧТ и КрТ.

*** p < 0,001 по сравнению с КрТ в соответствии с F -критерием.

У разных линий и гибридов частота початков с выполненными зерновками варьировала от 7 до 75 % (табл. 1); частота выполненных зерновок от общего числа семян — от 0,7 до 85,4 % и зависела от генотипа опылителя. При использовании линий ТП и ЧТ частота была значительно выше, чем у КрТ; частота початков с выполненными зерновками была наибольшей у ТП.

Из выполненных зерновок развивались диплоидные, триплоидные и тетрап-лоидные растения (табл. 2, рис. 2).

2. Плоидность растений, полученных из выполненных зерновок кукурузы ( Zea mays L.), завязавшихся в гетероплоидных скрещиваниях (2 n ½ 4 n ) (г. Саратов, 2022 год)

Линия, гибрид (2 n )	Опылитель (4 n )	Число растений с уровнем плоидности
		2 n	3 n	4 n
АТ ГПЛ	КрТ	1	1	1
	ЧТ	1	–	1
В47	ТП	–	–	2
КМ	КрТ	–	–	1
F 1 (КМ/АТ ГПЛ)	ТП	1	–	–
	ЧТ	1	4	–
F 1 (В47/АТ ГПЛ)	КрТ	1	–	–
F 3 (В47/АТ ГПЛ)	КрТ	1	2	–
	ТП	4	–	–
F 1 (КМ1/Сахарная 1)	ЧТ	2	–	–
	КрТ	–	2	–

Примечание. КМ — Коричневый Маркер, КрТ — Краснодарский Тетраплоид, ЧТ — Черная Тетра, ТП — Тетра Парий. Прочерки означают отсутствие данных

Для анализа плоидности эндосперма были отобраны выполненные зерновки из комбинаций F 3 (В47/АТ ГПЛ) ½ ТП и F 1 (КМ/Сахарное1) ½ КрТ, из которых развивались диплоиды, и АТ ГПЛ ½ КрТ и В47 ½ ТП, из которых развивались тетраплоиды (см. табл. 2).

Рис. 2. Метафазные пластинки диплоидного (a) и тетраплоидного (б) растений кукурузы ( Zea mays L.), выросших из выполненных зерновок, которые завязались на початках при скрещиваниях 18-10-4 (2 n ) ½ Тетра-Парий (4 n ) и В47 (2 n ) ½ Тетра-Парий (4 n ) (окрашивание ацетогематоксилином, шкала 20 мкм, 1000½, микроскоп AxioScope A1, «Zeiss», Германия) .

Согласно результатам исследования плоидности эндоспермов с помощью проточной цитофотометрии (табл. 3, рис. 3), во всех образцах наблюдалось несколько пиков флюоресценции, что следовало ожидать, учитывая известное явление эндополиплоидизации ядер эндосперма у кукурузы (9, 19, 20). У эндосперма диплоидного растения (3 n -стандарт), плоидность ядер которого должна быть не менее 3 n , среднее значение интенсивности флюоресценции 1-го пика соответствовало 95 ед. шкалы на оси Х, тогда как среднее значение для 2-го пика было 191 ед. (см. рис. 3, Б). Очевидно, что эти пики соответствовали содержанию ДНК 3С и 6С, поскольку пики 1С и 2С у ядер, выделенных из листа гаплоида ( n -стандарт), имели значения 35 и 70 ед. (см. табл. 3; рис. 3, А). Кроме того, в триплоидном эндосперме наблюдались пики, соответствовавшие более высоким значениям плоидно-сти (12С, 24С), которые, как и ожидалось, присутствовали вследствие эн-дополиплоидизации. У эндосперма тетраплоидной линии (6 n -стандарт) среднее значение 1-го пика флюоресценции было почти в 2 раза выше, чем у триплоидного эндосперма (182 ед.) и, по-видимому, соответствовало величине 6С (см. табл. 3). Кроме того, в гексаплоидном эндосперме наблюдались пики, соответствовавшие более высоким уровням плоидности (12C, 24C, 48C).

• 3.    Результаты анализа плоидности эндосперма зерновок кукурузы (Zea mays L.), завязавшихся в гетероплоидных скрещиваниях (2n ½ 4n), с помощью проточной цитометрии (г. Саратов, 2022 год)

Плоидность полученного Гибридная комбинация растения

Число ядер             Средние значения пиков флюоресценции, ед.

АТ ГПЛ ( n ), лист ( n -стандарт) АТ ГПЛ (2 n ), эндосперм (3 n -стандарт) АТ ГПЛ (2 n ) ½ КРТ (4n), зерновка ¹ 1                         4 n F 3 (В47/АТ ГПЛ) (2 n ) ½ ТП (4 n ), зерновка ¹ 2                   2 n F 3 (В47/АТ ГПЛ) (2 n ) ½ ТП (4 n ), зерновка ¹ 3                   2 n F 3 (В47/АТ ГПЛ) (2 n ) ½ ТП (4 n ), зерновка ¹ 4                   2 n F 1 (КМ/Сахарная1) (2 n ) ½ КрТ (4 n ), зерновка ¹ 5                 2 n F 1 (КМ/Сахарная1) (2 n ) ½ КрТ (4 n ), зерновка ¹ 7                 2 n F 1 (КМ/Сахарная1) (2 n ) ½ КрТ (4 n ), зерновка ¹ 8                 2 n В47 (2 n ) ½ ТП (4 n ), зерновка ¹ 9                                4 n В47 (2 n ) ½ ТП (4 n ), зерновка ¹ 10                               4 n ЧТ (4 n ), эндосперм (6 n -стандарт)

7781     35 (1C); 70 (2C) 3306                       96 (3С); 191 (6C); 388 (12C); 710 (24C) 2607                              173 (6C); 340 (12C); 649 (24С); 1230 (48C) 2696                              174 (6C); 340(12C); 661 (24С); 1263 (48С) 2604                              164 (6C); 321 (12C); 620 (24С); 1134(48С) 2719                              173 (6C); 343 (12C); 673 (24С); 1298 (48C) 2171                               175 (6C); 349 (12C); 667 (24С); 1286 (48C) 2726                              189 (6C); 362 (12C); 704 (24С); 1333 (48С) 2327                                 181 (6C); 368 (12C); 717 (24С); 1334 (48C) 2765                              171 (6C); 349 (12C); 679 (24C); 1298 (48C) 2654                              164 (6C); 333 (12C); 643 (24С); 1444 (48C) 1634                              182 (6C); 385 (12C); 756 (24C); 1427 (48C)

Примечание. КМ — Коричневый Маркер, ТП — Тетра-Парий, КРТ — Краснодарский тетраплоид, ЧТ — Черная Тетра.

Рис. 3. Плоидность ядер эндосперма выполненных зерновок кукурузы ( Zea mays L.), завязавшихся в гетероплоидных скрещиваниях ( 2 n % 4 n ): А — лист гаплоидного растения линии АТ ГПЛ ( n -стандарт); Б — эндосперм диплоидного растения линии АТ ГПЛ (3 n -стандарт); В — эндосперм выполненной зерновки, завязавшейся на початке АТ ГПЛ (2 n ), опыленном пыльцой КрТ (4 n ), из которой было получено тетраплоидное растение; Г — эндосперм выполненной зерновки, завязавшейся на початке В47 (2 n ), опыленном пыльцой ТП (4 n ), из которой было получено тетраплоидное растение; Д — эндосперм выполненной зерновки, завязавшейся на початке гибрида F 3 (В47/АТ ГПЛ) (2 n ), опыленного пыльцой ТП (4 n ), из которой было получено диплоидное растение; Е — эндосперм выполненной зерновки, завязавшейся на початке гибрида F 1 (КМ/Сахарная1) (2 n ), опыленного пыльцой КрТ (4 n ), из которой было получено диплоидное растение; # of events — число ядер в каждом пике, X Median — средняя по оси X для каждого пика флюоресценции, X CV — ошибка средней для каждого пика по оси X.

В отличие от эндосперма диплоидного растения линии АТ ГПЛ, в эндоспермах большинства выполненных зерновок от скрещиваний 2n ½ 4n средние значения 1-го пика флюоресценции были значительно выше (164189 ед.) и указывали на более высокое содержание ДНК, предположительно соответствовавшее 6С и выше. Такой результат наблюдался у эндосперма зерновок, из которых были получены как тетраплоидные гибриды (см. табл. 3, зерновки ¹¹ 1, 9, 10; рис. 3, В, Г), так и диплоидные F1(КМ1/Сахар-ная1) растения (см. табл. 3, зерновки ¹¹ 2-5, 7, 8; рис. 3, Д, Е). Эти данные указывают, что плоидность эндоспермов таких зерновок значительно превышала 3n. Возможно, эндоспермы развивались на основе слияния нередуцированных полярных ядер (2n + 2n), оплодотворенных диплоидным спермием (2n), в результате чего имели плоидность 6n. В таком случае соотношение родительских геномов в развивающемся эндосперме — 4м:2о, что соответствует соотношению 2м:1о, необходимому для развития полноценного эндосперма (10, 11).

Эти данные подтверждают сформулированную ранее гипотезу о развитии выполненных зерновок в скрещиваниях 2 n ½ 4 n , сформировавшихся из нередуцированных зародышевых мешков (ЗМ) (14, 15). Как известно, формирование нередуцированных ЗМ — это один из компонентов гамето-фитного апомиксиса, в связи с чем полученные данные указывают на наличие этого компонента у ряда изученных линий и гибридов кукурузы. Несколько сниженные значения флюоресценции ядер эндосперма у таких гибридных зерновок по сравнению с флюоресценцией ядер эндосперма тет-раплоида могут быть объяснены частичной элиминацией хромосом, которая могла иметь место в сложном гибридном геноме.

Примечательно, что в случае оплодотворения нередуцированнных ЗМ диплоидной пыльцой гибридным может быть не только эндосперм (6 n ), но и зародыш (4 n ). Действительно, некоторые выполненные зерновки давали такие тетраплоидные растения (см. табл. 2). Тем не менее в ряде случаев из выполненных зерновок развиваются диплоидные растения, причем фенотипы этих растений весьма сильно схожи с фенотипом материнских линий (14, 15). Однако проведенное нами ранее генотипирование «матро-клинных» диплоидов с помощью полиморфных кодоминантных SSR-маркеров, дифференцирующих материнские линии и использованную в скрещиваниях тетраплоидную линию ЧТ, выявило, что такие диплоиды, будучи гомозиготными по материнским маркерам для большинства хромосом, оказываются гетерозиготным по одной-двум хромосомам (а в некоторых случаях и по большему числу хромосом) (16).

Исходя из этих фактов, мы высказали предположение о том, что диплоидная природа растений, развивающихся из выполненных зерновок, формирующихся у некоторых линий кукурузы в 2 n ½ 4 n скрещиваниях, оказывается следствием элиминации хромосом, при этом элиминируют преимущественно хромосомы тетраплоидной отцовской линии (16). Такая элиминация хромосом отцовских родителей — широко распространенное явление при отдаленной гибридизации (21-23), а также при скрещиваниях с линиями-гаплоиндукторами (24-26). В наших экспериментах, однако, в отличие от работ по получению гаплоидов, были получены диплоиды, появление которых, по-видимому, обусловлено наличием нередуцированных ЗМ у материнских линий кукурузы.

Следует отметить, что частота формирования выполненных зерновок в скрещиваниях 2n ½ 4n в наших экспериментах значительно различалась у разных линий и гибридов (см. табл. 2). По-видимому, это следствие влияния генотипа на частоту формирования нередуцированных ЗМ. Однако сильнее интригуют данные о влиянии генотипа опылителя — тетраплоид-ной линии, которая служит «индуктором» этого процесса. Использованные в нашем опыте тетраплоиды различались по своей «индуцирующей» способности (см. табл. 1). Как известно, у линий-гаплоиндукторов индуцирующая способность связана с наличием мутации в гене прицентромерного гистона CENH3, участвующего в прикреплении хромосом к веретену деления и обусловливающего элиминацию хромосом опылителя в гибридном геноме (27, 28). Однако в наших экспериментах наблюдалась не только элиминация хромосом опылителя (16), но и разная частота формирования самих выполненных зерновок при опылении разными опылителями. Очевидно, что это связано с процессами, происходящими на более ранних стадиях развития и определяется, возможно, разной оплодотворяющей способ- ностью спермиев разных тетраплоидов.

Таким образом, при определении плоидности эндосперма выполненных зерновок кукурузы, развившихся в гетероплоидных скрещиваниях (2 n x 4 n ), с помощью проточной цитометрии были получены данные, подтверждающие гипотезу о развитии таких зерновок на основе нередуцированных зародышевых мешков — одного из ключевых элементов апомиктич-ного размножения растений. Эти зерновки содержат гексаплоидный эндосперм и тетраплоидный или диплоидный зародыш гибридного происхождения, у которого преобладают хромосомы материнской линии, но могут присутствовать отдельные хромосомы отцовского родителя. На первый взгляд, полученные результаты указывают на отсутствие диплоидного апомиксиса у изученных линий и гибридов. Однако они показывают наличие у них одного из его основных компонентов — нередуцированных зародышевых мешков. Но наличие только этого компонента оказывается недостаточным для развития апомиктичных растений. Полученные данные свидетельствуют об эффективности применения тетраплоидных опылителей для выявления нередуцированных зародышевых мешков у линий и гибридов кукурузы. Подобный подход может в дальнейшем использоваться в работах по конструированию апомиксиса у этой важной сельскохозяйственной культуры посредством геномного редактирования. Следует также отметить, что полученные нами результаты подкрепляют балансовую теорию развития эндосперма прямыми экспериментальными доказательствами, поскольку исследование плоидности эндосперма у зерновок, развившихся в гетеро-плоидных скрещиваниях, которые использовались для обоснования балансовой теории эндосперма, посредством проточной цитофотометрии нами проведено впервые.

ФГБНУ Федеральный аграрный научный центр Юго-Востока,