Возрастные изменения морфометрических характеристик нейронов, клеток микроглии и активность ферментов антиоксидантной защиты в коре головного мозга человека на начальных этапах постнатального онтогенеза

Введение. Известно, что церебральные нейроны относятся к числу наиболее уязвимых и чувствительных к оксидативному стрессу (ОС) клеток. Данное обстоятельство иллюстрирует высокое функциональное значение глиальных клеток, обеспечивающих трофику нейронов и их защиту от разнородных повреждающих воздействий [1]. Отмеченные функции глиальных клеток наименее изучены в отношении микроглиоцитов, на долю которых приходиться всего 6,5 % от всего количества глиоцитов [2]. Данная категория глиальных клеток имеет мезенхимальное происхождение и может рассматриваться в качестве резистентного макрофага центральной нервной системы (ЦНС). В последнее время выявлена важная роль микроглии в развитии мозга путем регулирования количества нейронных клеток-предшественников и нейронов во время внутриутробного развития и раннего постнатального онтогенеза [3]. Микроглиоциты фагоцитируют «лишние» клетки в пролиферативных зонах ЦНС, регулируя их численность, что является важным для правильного развития мозга. Остается недостаточно изученной роль микроглиоцитов в регуляции антиоксидантной защиты (АОЗ) головного мозга (ГМ), играющей общеизвестную роль в нейрогенезе на ранних этапах постнатального онтогенеза [4]. Наиболее значимыми компонентами АОЗ являются такие ферменты как Cu-, Zn-и Mn-зависимые суперок-сиддисмутазы (СОД), каталаза, церулоплазмин (ЦП), неферментные антиоксиданты [5].

Цель исследования – оценка возрастных изменений морфометрических характеристик нейронов, клеток микроглии в сопоставлении с активностью ферментов АОЗ в коре головного мозга человека на начальных этапах постнатального онтогенеза.

Материал и методы исследования. Препараты ГМ получены при аутопсии 93 трупов людей, погибших в возрасте от 1 дня до 21 года от заболеваний и травм, не связанных с первичным поражением ГМ. Материал для исследования предоставлен Челябинским областным бюро судебно-медицинской экспертизы и областным детским патологоанатомическим бюро. Наиболее частой причиной смерти явилась механическая асфиксия (n = 43), реже – утопление (n = 21), в 29 случае смерть наступила в результате пневмонии, травм и отравлений. Препараты фетального ГМ получены при аутопсии 15 плодов, погибших в результате прерывания беременности по медицинским показаниям на 25-30-й неделях гестации. Во всех случаях образцы ГМ для биохимического исследования получали не позднее 12 часов с момента наступления смерти и для морфологического исследования не позднее 24 часов.

В соответствии с возрастной периодизацией [6], полученные образцы ГМ были разделены на 8 групп: плоды 2-й половины беременности, новорожденные (1-10 дней), грудной ребенок (от 11 дней до 1 года), раннее детство (от 1 года до 3 лет), 1-й период детства (3 – 7 лет), 2-й период детства (8 – 12 лет для мальчиков, 8 – 11 лет для девочек), подростковый возраст (13 – 16 лет для мальчиков, 12 – 15 лет для девочек), юношеский возраст (17 – 21 лет для мужчин, 16 – 20 лет для женщин).

Количество нейронов и микроглиоцитов, активность каталазы, Cu-,Zn-СОД и содержание ферментно-активного церулоплазмина (ФАЦП) изучали в поле 6 коры ГМ. Микроглиоциты выявляли по методике Мийагавы в модификации Александровской [7], нейроны – методом окраски крезиловым фиолетовым по Нисслю [8]. Подсчет глиальных клеток и пирамидных нейронов проводили в V-ом слое коры поля 6. Активность каталазы оценивали по скорости снижения уровня перекиси водорода (Н2О2) в среде инкубации [9]. Содержание ФАЦП определяли модифицированным методом [10] при увеличении времени инкубации до 180 мин. Активность Cu-, Zn-СОД регистрировали с помощью колориметрического метода [11].

Подсчет количества нервных и глиальных клеток, площади профильного поля перикариона производился на микроскопе Leica DMRXA с помощью компьютерной программы анализа изображения Image Scope, Leica (Германия). Статистическую сопоставимость (однородность) сформированных возрастных групп в целом оценивали по критерию Краскелла-Уоллиса. В случае выявления статистической неоднородности изученных выборок межгрупповые различия уточнялись по U-критерию Манна-Уитни. Изучение взаимосвязей проводили путем расчета коэффициентов корреляции по Спирмену (rs). Проверку статистических гипотез проводили при критическом уровне р=0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенного исследования на начальных этапах постнатального онтогенеза установлено снижение числа пирамидных нейронов в поле 6 коры ГМ, которое к раннему детству достигло значимых отличий относительно плодов 2-й половины беременности и новорожденных (табл.). В период 8 лет – 21 год изучаемый показатель не изменялся, оставаясь достоверно ниже фетального уровня и значений новорожденных и грудных детей. Именно в данный возрастной период площадь профильного поля перикариона пирамидных нейронов достигала максимальных значений, в 1,6 раза превышая показатели плодов 2-й половины беременности. Число пирамидных нейронов поля 6 коры больших полушарий в изученные возрастные периоды отрицательно коррелировало со значениями календарного возраста (r_s = - 0,657; p < 0,001), а размер их тел – наоборот (r_s = 0,756; p < 0,001). Выявленные возрастные изменения нейронов в поле 6 коры больших полушарий сопровождались нарастанием числа клеток микроглии (таблица). Увеличение данного параметра наблюдалось сразу после рождения и продолжалось в последующие изученные возрастные периоды. Число клеток микроглии в поле 6 достигало максимальных значений в том возрасте, когда число пирамидных нейронов было минимальным. В поле 6 коры ГМ число клеток микроглии прямо коррелировало с абсолютными значениями календарного возраста (r_s = 0,459; p < 0,001).

Морфологические изменения во фронтальной коре происходили на фоне увеличения активности ферментов АОЗ (таблица). Прежде всего это касалось ФАЦП, содержание которого возрастало в 1,9 раза относительно фетальных значений уже в период новорожденности. В последующие изученные возрастные периоды уровень ФАЦП уменьшался, оставаясь выше значений плодов 2-й половины беременности и новорожденных. Активность каталазы в поле 6 коры ГМ также на-

Таблица.

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА И РАЗМЕРА ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ, ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРОГЛИИ, СОДЕРЖАНИЯ ФЕРМЕНТНО-АКТИВНОГО ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА, АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ПОЛЕ 6 КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА

НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА [M±m]

Примечание: р < 0,05 U-критерий Манна-Уитни – ¹ – с группой «плоды»; ² – с группой «новорожденные»; ³ – с группой «грудной возраст»; ⁴ – с группой «раннее детство»; ⁶ – с группой «второй период детства» при значимой неоднородности показателей (р < 0,05; критерий Краскелла-Уоллеса).

растала, достигая максимального уровня во 2-м периоде детства. Исследованный отдел коры характеризовался прямой корреляцией между активностью каталазы и календарным возрастом (rs = 0,395; p = 0,001). Также установлена значимая корреляционная связь между число клеток микроглии и активностью каталазы (rs = 0,731; p = 0,040). В изученных возрастных периодах активность СОД снижалась в раннем детстве относительно показателей новорожденных и грудных детей, после чего увеличивалась к подростковому возрасту.

Обсуждение результатов исследования. Результаты проведенного исследования продемонстрировали параллельное нарастание плотности микроглиоцитов и снижение числа пирамидных нейронов в поле 6 коры ГМ. Данный факт хорошо согласуется с представлениями о микроглиальном клиренсе «излишка» низкодифференцированных нейрональных предшественников [3]. Справедли- вость данного положения подтверждается также однонаправленной динамикой нарастания числа микроглиальных клеток и площади профильного поля перикариона нейронов. Установленные факты позволяют считать, что возрастное накопление микроглиоцитов способствует процессу дифференцировки нейрональных предшественников и одновременно ограничивает избыточный пролиферативный потенциал стволовой нервной клетки. Установленное в работе соответствие нарастания ферментов АОЗ (ФАЦП, каталазы) и числа микроглиальных клеток свидетельствует о вероятной роли микроглиоцитов в онтогенетическом становлении АОЗ ГМ.

В целом, результаты проведенного исследования иллюстрируют регуляторную роль клеток микроглии во фронтальной коре формирующегося мозга человека: с одной стороны это связывают с предотвращением избыточной пролиферации нейрональных предшественников, а с другой – с усилением АОЗ дифференцирующихся пирамидных нейронов. При это, важно подчеркнуть, что нарушение отмеченного баланса ведет к развитию патологических состояний. Известно, что чрезмерная пролиферация нейронов имеет прямое отношение к развитию расстройств аутистического спектра [3], а снижение АОЗ мозга является важнейшим механизмом нейродегенеративного процесса [12].