Всхожесть, биохимические и цитогенетические характеристики проростков после долговременного хранения семян гороха в условиях вечной мерзлоты

Богатство растительного мира представляет предмет особого внимания и забот современного общества. Он обладает функциональным многообразием жизненных форм, многовариантностью способов размножения и развития, адаптивных стратегий, устойчивостью к стрессам и т.д. Биологическое разнообразие обеспечивает устойчивость и надежность биоценозов и экосистем. Одним из первых в 1920-1930-е годы начал сбор и изучение генетического многообразия культурных растений академик Н.И. Вавилов (1). Появление этого направления имело огромное значение для мировой селекции, позволив использовать биологические ресурсы растений планеты в качестве источников генов для получения исходного материала при целенаправленном отборе. В настоящее время во Всероссийском НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова собрана коллекция, которая относится к крупнейшим в мире и наиболее представительным. Большая ее часть хранится в контролируемых условиях (при +4 °С и частично при -18 °С) в подземном хранилище филиала института (Кубанский генетический банк семян). Образцы находятся в герметичной или полузакрытой таре со сроком хранения без пересевов 25-30 лет. Между тем исследования на 2263 видах, проведенные после девяти лет хранения, показали, что низкие положительные температуры не позволяют длительно сохранять семена без ухудшения качества и уменьшения жизнеспособности вследствие биохимических процессов старения и появления хромосомных аберраций (2, 3).

Для долговременного хранения предпочтительны околонулевые отрицательные температуры в диапазоне от - 6 до - 8 ° C, так как охлаждение, наряду со снижением влажности, резко подавляет интенсивность всех биологических процессов в семенной массе, угнетает жизнедеятельность микроорганизмов. Поэтому оно широко используется в практике хранения как эффективный способ повышения стойкости семян. Страны, имеющие подобные коллекции, хранят семенной материал в рефрижераторных камерах при строго определенных температурах. В таких условиях семена не теряют всхожести 70 и даже 100 лет (4, 5). В связи с этим в качестве помещений для банков семян перспективно использовать подземные хранилища в толщах вечной мерзлоты Якутии с естественным образом поддерживаемыми оптимальными температурными условиями. Криолитозона (вечная мерзлота) — толща горных пород различного состава, имеющая отрицательную температуру, занимает около 70 % территории России и заключает в себе громадные холодовые ресурсы (6).

Цель работы — изучить влияние долговременного хранения семян гороха в разных семенных банках России и в условиях вечной мерзлоты подземной лаборатории Института мерзлотоведения (ИМЗ СО РАН) на всхожесть и цитолого-биохимические характеристики их проростков.

Методика. Материалом для исследований послужили семена и полученные из них проростки четырех сортов гороха ( Pisum sativum L.) — VIT, Чифлик 5 (Болгария), Cartess Ckipper (Великобритания), Zuckerbsen Am-brosea (Германия), долговременно (от 12 лет до 31 года) хранившиеся в разных семенных банках России (в средней полосе, на юге и на Урале) и в подземной лаборатории ИМЗ СО РАН в герметично закрытых стеклянных сосудах объемом 100 мл.

Физиологический метод оценки эффекта долговременного хранения состоял в определении всхожести на 7-е сут после посева; из-за небольшого количества имеющегося семенного материала проращивание проводили после предварительного охлаждения в 4 повторностях (по 10 шт.) в чашках Петри с использованием ватной подложки с фильтровальной бумагой, увлажненной дистиллированной водой до полной влагоемкости при температуре 20 ° С (7).

Биохимический метод оценки включал определение в тканях проростков гороха активности пероксидазы — по стандартной методике (8), активности супероксиддисмутазы (СОД) — как описано C.N. Giannopolitis с соавт. (9), суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО) — по В.С. Асатиани (8). Также учитывали активность белоксин-тезирующих, ДНК-реплицирующих и репарирующих систем с применением радиоиндикаторного метода (10).

Цитологический анализ проводили по общепринятой методике (11). Перед фиксацией корешков у проростков длиной около 2,5 см на них воздействовали холодом в течение 24 ч, далее обрабатывали спиртово-уксусной смесью (3:1) и окрашивали ацетоорсеином. Давленые препараты, приготовленные стандартным способом, просматривали под световым микроскопом (Axiostar plus, «Carl Zeiss», Германия) при увеличении *100. Митотический индекс рассчитывали как отношение числа клеток в поздней про-, мета-, ана- и телофазе к общему числу просмотренных. Наличие мостов и фрагментов учитывали в анафазах, которые еще не вступили в позднюю телофазу. Процент клеток с нарушениями вычисляли относительно числа просмотренных анафаз.

Комплексный цитолого-биохимический метод (12) состоял в одно временном учете включения 3Н-тимидина в ДНК и 14С-лейцина в синтезируемые белки (для характеристики соответственно суммарной активности репликативного, репаративного синтеза ДНК и трансляции мРНК при биосинтезе белков) и в определении митотического индекса делящихся клеток (для выявления скорости репликации ДНК при клеточном делении). Все характеристики выражали в относительных единицах применительно к проросткам из семян с наименьшим сроком хранения (11-13 лет). Активность генома оценивали в процессах репарации (крепар.) — разностью нормированных (N) относительно контроля величин (включение 3H-тимидина)N - (митотический иццекс)N, в процессах трансляции белков (ктрансл.) — нормированной величиной (включение 14С-лейцина)N; общую активность генома (коаг) описывали уравнением: коаг = крепл. + крепар. + ктрансл.

С учетом вклада состояния системы антиоксидантной защиты (к_аоз) в устойчивость генома вычисляли в относительных единицах коэффициент общей относительной устойчивости генома (к_оуг). При этом исходили из представления о том, что устойчивость генома обратно пропорциональна его объему. В свою очередь, этот параметр пропорционален его активно^сти: к оуг = ^(к аоз ⁺ к репар. Х/^ оаг -

1. Изученные сорта гороха посевного ( Pi-sum sativum L.) и условия их хранения в семенных банках и в зоне вечной мерзлоты!

Происхождение	Место хранения	Год урожая	Срок хранения, число лет
	Сорт VIT
Болгария	с. Михнево	1992	12
	г. Крымск	1973	31
	г. Якутск	1978	26
	Сорт Ч и ф л	и к 5
Болгария	г. Екатеринбург	1991	13
	г. Екатеринбург	1973	31
	г. Якутск	1977	27
Сорт Cartess		C к i p p e r
Великобритания г. Крымск		1976	28
	г. Крымск	1993	11
	г. Якутск	1977	27
Сорт	Zuckerbsen	Ambrosea
Германия	г. Крымск	1977	27
	г. Екатеринбург	1992	12
	г. Якутск	1978	26

Примечание. г. Михнево (Московская обл.), г. Крымск (Краснодарский край), г. Екатеринбург (Свердловская обл.).

Статистическую достоверность результатов определяли согласно описанию (13).

Результаты. Краткая характеристика изученных сортов приведена в таблице 1.

Проращивание семян и определение всхожести на 7-е сут после посева показало, что у всех исследуемых сортов гороха неспособными к прорастанию оказались семена, хранившиеся в течение 27-31 года в семенных банках городов Крымска и Екатеринбурга (табл. 2). В связи с этим сравнили семена, хранившиеся от 26 до 27 лет в г. Якутске (ИМЗ СО РАН), с хранившимися в семенных банках дру гих городов от 11 до 12 лет.

Сорт VIT обладал высокой лабораторной всхожестью. У семян со сроком хранения 12 лет (г. Михнево) она составила 80 %, у хранившихся в течение 26 лет в условиях вечной мерзлоты — 100 %.

2. Всхожесть и цитолого-биохимические характеристики проростков у разных сортов гороха ( Pisum sativum L.) в зависимости от условий хранения семян ( X ± х )

А       | Б 1 В 1 Г 1 Д 1 Е 1 ж 1 З 1 И г. Михнево 12 80,0±8,0 Сорт VIT 8,5±0,9    1,5±0,2 3,0±0,3 0,20±0,02 30,0±0,3 9,0±0,1 г. Крымск г. Якутск 31 26 0 100,0±10,0 8,0±0,8    0,9±0,1 2,0±0,2 1,00±0,01 100,0±1,0 12,0±0,1 г. Екатеринбург 13 50,0±5,0 Сорт Ч и ф л и к 8,2±0,8    3,0±0,3 5 5,0±0,5 0,20±0,02 90,0±0,9 13,0±0,1 г. Екатеринбург г. Якутск 31 27 0 100,0±10,0 10,6±1,6    2,0±0,2 3,0±0,3 0,40±0,04 20,0±0,2 15,0±0,2 г. Крымск г. Крымск 28 11 0 90,0±0,9 Сорт C a r t e s s C к i 6,9±0,7    3,0±0,3 PPer 6,0±0,6 0,50±0,05 20,0±0,2 12,0±0,1 г. Якутск          27

г. Крымск        27

г. Екатеринбург 12

г. Якутск 26 Примечание. А — тический индекс, %; фмоль/(г/сут); Ж —

Продолжение таблицы 2 70,0±0,7    6,7±0,7    3,0±0,3    6,0±0,6   0,10±0,01  40,0±0,4   24,0±0,2

Сорт Zuckerbsen Ambrosea 0 60,0±0,6  20,1±2,0    0,9±0,1    2,0±0,2   0,90±0,10  20,0±0,2   23,0±0,2

60,0±0,6   14,1±1,4    1,0±0,1    4,0±0,4   0,30±0,00  20,0±0,2   10,0±0,1

место хранения; Б — срок хранения, число лет; В — всхожесть, %; Г — мито-Д — включение 14С-лейцина, пмоль/(г^сут); Е — включение 3Н-тимидина, активность пероксидазы, нмоль/(г • мин); 3 — активность супероксиддисмутазы, нмоль/(г^мин); И — содержание низкомолекулярных антиоксидантов, мкг-эквкверц./г; г. Михнево — Московская обл., г. Крымск — Краснодарский край, г. Екатеринбург — Свердловская обл.

Цитологические исследования показали, что митотический индекс при разных сроках хранения достоверно не изменялся. Однако анафазный анализ клеток меристематической ткани корешков выявил аберрантные клетки (табл. 3). Отмечалось появление хромосомных аберрации в виде мостов и фрагментов, причем число мостов было в 3 раза больше в апикальной меристеме корешков в случае, когда семена хранились в г. Михнево.

• 3.    Цитологические характеристики клеток меристематической ткани в корешках проростков у разных сортов гороха ( Pisum sativum L.) в зависимости от условий хранения семян

  А       |	Б	1 В	1 Г 1 Д 1	Е	1 Ж |	3
  г. Михнево	12	10628	Сорт VIT 908       8,5±0,9	50	6/12,0	2/4,0
  г. Якутск	26	4945	243       8,0±0,8	50	2/4,0	2/4,0
  г. Екатеринбург	13	5623	Сорт Ч и ф л и к 5 464      8,2±0,8	50	0	0
  г. Якутск	27	14204	1440      10,6±1,1	50	2/4,0	0
  г. Крымск	11	Со 3362	рт Cartess Ckipper 210      6,9±0,7	50	4/8,0	2/4,0
  г. Якутск	27	1970	138      6,7±0,7	50	0	0
  г. Екатеринбург	12	Сорт 5425	Zuckerbsen Ambrosea 1089      20,1±2,0	50	12/24,0	2/4,0
  г. Якутск	26	3860	547      14,1±1,4	50	6/12,0	0

• 4.    Расчетные значения физиологических и цитолого-биохимических характеристик клеток проростков гороха ( Pisum sativum L.) в зависимости от условий хранения семян

Примечание. А — место хранения; Б — срок хранения, число лет; В — число исследованных клеток, шт., Г— число клеток в митозе, шт., Д — митотический индекс, % ( X ± х ); Е — число исследованных анафаз, шт.; Ж — мосты, шт/%; 3 — фрагменты, шт/%; г. Михнево — Московская обл., г. Крымск — Краснодарский край, г. Екатеринбург — Свердловская обл.

Место хранения	Срок хранения, число лет		Всхожесть семян (нормированное значение)	kаоз	kоаг	kрепар.	kоуг
г. Михнево	12		Сорт VIT 1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
г. Якутск	26		1,3	3,2	0,7	0,8	2,2
г. Екатеринбург	13		Сорт Ч и ф л и к 5 1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
г. Якутск	27		2,0	1,1	0,7	0,3	0,8
г. Крымск	11	Сорт Cartess Ckipper 1,0		1,0	1,0	1,0	1,0
г. Якутск	27		0,8	1,4	1,0	1,0	1,9
г. Екатеринбург	12	Сорт Zuckerbsen Ambro 1,0		sea 1,0	1,0	1,0	1,0
г. Якутск	26		1,0	0,6	1,6	2,3	1,0

Примечание. к_аО з , к_оаг, к репар. , к оуг — коэффициенты, учитывающие общую антиоксидантную защиту, общую активность генома, активность генома в процессах репарации, общую относительную устойчивость генома; г. Михнево — Московская обл., г. Крымск — Краснодарский край, г. Екатеринбург — Свердловская обл.

Результаты, полученные при биохимических исследованиях, показали, что наиболее активными были системы антиоксидантной защиты у проростков гороха из семян, хранившихся в условиях мерзлотной шахты ИМ3 СО РАН. Так, отмечалось увеличение активности ферментов СОД в 5 раз, пероксидазы — в 3 раза, содержания НМАО — на 25 % по срав- нению с проростками из семян со сроком хранения 12 лет (г. Михнево, см. табл. 2).

Применение комплексного цитолого-биохимического метода позволило установить, что на фоне усиления антиоксидантной защиты у проростков из семян со сроком хранения 26 лет снижались показатели активности генома в процессах репликации — на 33 %, трансляции — на 40 % и репарации — на 20 % (см. табл. 2, 4).

У сорта Чифлик 5 обнаружили значительное изменение физиологических и цитолого-биохимических характеристик (см. табл. 2). При хранении семян в течение 13 лет в г. Екатеринбурге лабораторная всхожесть уменьшилась на 50 %, тогда как у образцов, находившихся в подземной шахте ИМЗ СО РАН в течение 27 лет, всхожесть составила 100 %. Необходимо отметить, что у гороха, хранившегося в условиях вечной мерзлоты, на фоне высокого значения митотического индекса анафазный анализ выявил наличие мостов (4 %, см. табл. 3), что, возможно, связано со снижением репаративной способности на 70 % (см. табл. 4). Между тем у 50 % проростков гороха с 11-летним сроком хранения клеток с повреждениями не наблюдали.

Степень антиоксидантной защиты гороха после 27 лет хранения увеличилась за счет активности пероксидазы — в 2 раза, содержания НМАО — на 13 %. Активность СОД была меньше в 4,5 раза (см. табл. 2). Относительная устойчивость генома снизилась на 20 %. Активность генома в процессах репликации уменьшилась на 33 %, трансляции — на 40 % и репарации — в 3 раза (см. табл. 4).

Семена сорта Cartess Ckipper, хранившиеся 11 лет в семенном банке г. Крымска, снизили всхожесть на 10 %, тогда как после 27 лет хранения в условиях г. Якутска она составила 70 % (см. табл. 2). При сравнении цитолого-биохимических показателей у проростков оказалось, что митотический индекс при разных сроках хранения достоверно не изменялся. В клетках корешков гороха (11 лет хранения, г. Крымск) были найдены хромосомные аберрации в виде мостов (8 %) и фрагментов (4 %, см. табл. 3). Активность генома в процессах репликации, трансляции и репарации не изменялась. Однако антиоксидантная защита клеток оказалась в 2 раза выше у проростков из семян, которые содержались в ИМЗ СО РАН, за счет активации СОД и увеличения содержания НМАО. При этом активность пероксидазы оказалась меньше в 5 раз. Относительная устойчивость генома увеличилась на 17 % (см. табл. 2 и 4).

Не менее интересные данные были получены при исследовании сорта Zuckerbsen Ambrosea. Хранение гороха в г. Екатеринбурге в течение 12 лет снизило его всхожесть на 40 %. После 26 лет хранения в г. Якутске всхожесть гороха также снизилась на 40 % (см. табл. 2). Скорость деления меристемных клеток в корешках проростков при 12-летнем хранении семян в г. Екатеринбурге оказалась выше на 30 %, также наблюдалось появление мостов (24 %) и фрагментов (4 %). При хранении семян в условиях вечной мерзлоты анафазный анализ меристематических клеток проростков показал наличие мостов (12 %, см. табл. 3). Кроме того, более длительное хранение при постоянных температурах увеличило активность генома в процессах репликации в 2 раза, трансляции — на 10 % и репарации — в 2,3 раза (см. табл. 2). Степень антиоксидантной защиты уменьшилась за счет снижения активности пероксидазы в 3,0 раза и содержания НМАО в 2,3 раза. Активность СОД не изменялась (см. табл. 4). У указанных сортов наличие хромосомных аберраций в клетках сопровождалось снижением репаративной способности и компенсировалось повышением активности антиоксидантных систем.

При длительном хранении семян гороха в подземной шахте ИМЗ СО РАН у сортов Zuckerbsen Ambrosea и Cartess Ckipper всхожесть семян составила 60-70 %, также обнаружили меньшую долю аномальных митозов по сравнению с таковой в вариантах, когда коллекционные образцы хранились от 11 до 12 лет в других условиях.

Таким образом, сравнение всхожести семян и цитолого-биохимических характеристик клеток в тканях полученных из них проростков у четырех сортов гороха посевного в зависимости от места и времени хранения семенного материала свидетельствует, что использование подземных хранилищ в толщах вечной мерзлоты Якутии представляется весьма перспективным. Установлено, что при долговременном хранении (от 26 до 27 лет) в условиях многолетнемерзлых грунтов всхожесть семян у сортов VIT и Чифлик 5 составляла 100 %, а небольшое число аномальных митозов (до 4 %) в меристематических клетках корешков и повышенная активность антиоксидантных систем в клетках тканей проростков указывали на наилучшую сохранность и неизменность генетической конституции семенного материала по сравнению с семенами, хранившимися в течение 12-13 лет (всхожесть 50 %) в других условиях. Лишь при 11-летнем хранении семян сорта Cartess Ckipper в г. Крымске показатель всхожести на 20 % превышал таковой у аналогичных семян, хранившихся 27 лет в г. Якутске. По показателю всхожести (60 %) влияние 12-летнего хранения семян сорта Zuckerbsen Ambrosea в г. Екатеринбурге оказалось сопоставимо с эффектом 26-летнего хранения в условиях вечной мерзлоты. Следует отметить, что хранение семян изучаемых сортов в течение 27-31 года в южном регионе и на Урале приводило к полной потере всхожести. По-ви-димому, вечная мерзлота обеспечивает преимущество в сроках хранения, ограничивая деятельность микроорганизмов и старение семенного материала. Кроме того, целесообразность создания таких хранилищ обусловлена низкими энергетическими затратами.

Авторы признательны профессору Б.И. Иванову за предоставление семенного материала для проведения исследований.