Введение в культуру клеток у растений, используемых в качестве кормовых, лекарственных и декоративных, для получения стрессоустойчивых форм

Большинство представителей декоративных растений, входящих в состав мавританского газона (лужайка низкорослых злаковых и цветущих луговых трав — райграса, клевера, василька, мака, льна декоративного, колокольчика, брахикомы, хризантемы, ромашки, астры и т.д.) (1), — хорошие медоносы, некоторые имеют важное кормовое и лекарственное значение. Так, райграс относится к наиболее ценным по кормовым достоинствам злакам (1, 2). Он характеризуется коротким вегетационным периодом (65-70 сут), пастбищеустойчивостью и высокой отавностью (три укоса за вегетацию), его включают в травосмеси при создании культурных пастбищ и сенокосов в северо-западных, западных и центральных районах лесной зоны. Райграс пастбищный (многолетний) возделывают на зеленый корм и сено (содержание протеина в зеленой массе — 3,2 %, клетчатки — 8 %) (3), он очень устойчив к изнашиванию благодаря быстрому отрастанию побегов и листьев. Представители семейства льновых — не только источники растительного масла, волокна, но и кормовые культуры, медоносы. Растения некоторых сортов хризантемы килеватой, у которой в листьях и цветках содержится в-каротин, используют в качестве лекарственных (как витаминное средство и для повышения иммунитета). Клевер белый (ползучий) — высокоценное кормовое и медоносное растение, при выращивании с райграсом, тимофеевкой и другими злаками он повышает кормовое достоинство луговых травосмесей (увеличивается содержание сырого протеина, жира, фосфора, калия, кальция и снижается содержание клетчатки), а также их урожайность благодаря обеспечению злаковых компонентов азотом (4). Клевер белый используется также в качестве лекарственного растения (5).

В то же время для таких растений часто характерна повышенная чувствительность к неблагоприятным экологическим факторам. Для получения стрессоустойчивых форм можно использовать биотехнологические подходы. Например, получены растения кормовой культуры полевицы побегоносной, устойчивые к тяжелым металлам (6, 7), пшеницы, устойчивой к корневому затоплению (8) и кукурузы — к засухе (9).

Для клеточной селекции необходимо ввести растения в культуру клеток. Образование каллусов и регенерация зависит от множества факторов, в первую очередь от вида растения, состава питательной среды и условий культивирования. Даже у близкородственных таксонов, например клевера и люцерны, реакция на световые, температурные и гормональные агенты в культуре клеток различается (10). Ряд сложноцветных уже введены в культуру клеток: оптимизирован независимый от генотипа способ регенерации побегов из семян подсолнечника in vitro (11), подобраны условия для культирования каллусных линий Stevia rebaudiana Bertoni (12).

Целью нашего исследования было введение в культуру клеток райграса пастбищного, льна крупноцветкового, брахикомы иберисолистной, хризантемы килеватой и клевера ползучего.

Методика. В работе использовали семена райграса пастбищного ( Lolium perenne L.), льна крупноцветкового сорта Голубой ( Linum grandiflo-rum L.), брахикомы иберисолистной сорта Голубая неженка ( Brachycome iberidifolia L.), клевера ползучего сорта Белый ( Trifolium repens L.), хризантемы килеватой сорта Радость ( Chrysanthemum carinatum L.). Для получения каллусов и регенерации растений применяли агаризованные питательные среды Мурасиге и Скуга (MC) (13) и Гамборга (B₅) (14) с разным содержанием сахарозы и регуляторов роста. В среду в различных концентрациях и комбинациях вносили ауксины — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), а-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК); цитокинины — 6-бензиламинопурин (6-БАП), кинетин. Для регенерации хризантемы и брахикомы использовали половинную концентрацию компонентов среды МС с разным соотношением фитогормонов. Семена, которые использовали в качестве эксплантов, стерилизовали 1-кратной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия, в течение 15-30 мин (в зависимости от вида растения), затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Оптимальное время стерилизации определяли на основании учета жизнеспособности и доли зараженных первичных эксплантов.

Частоту каллусообразования учитывали как процентное отношение числа образовавшихся каллусов к общему числу эксплантов, помещенных на питательную среду, частоту побегообразования — как отношение числа каллусов с побегами к общему числу каллусов на среде для морфогенеза.

Доверительный интервал рассчитывали с помощью t -критерия Стьюдента (надежность — 95 %).

Резуёътаты. Для введения в культуру клеток райграса пастбищного семена высаживали на среду МС с разными концентрациями 2,4-Д (от 2 до 10 мг/л; из-за сильной зараженности время стерилизации раствором, содержащим гипохлорит натрия, 20 мин). Наибольшее каллусообразова-ние наблюдали на средах с 2,4-Д в концентрации 4 мг/л (58,1 %) и 6 мг/л (54,3 %) (табл. 1). В этих условиях в течение 18-21 сут формировался каллус белого или светло-желтого цвета. Морфогенные каллусы получали культивированием на среде МС без гормонов; использование сред, содержащих фитогормоны, не приводило к повышению частоты образования таких каллусов. Значит, оптимальной для каллусобразования была среда МС с 4 мг/л 2,4-Д, для регенерации — среда МС без гормонов и для укоренения — половинная концентрация компонентов среды МС без гормонов.

Для введения в культуру клеток льна крупноцветкового семена вы-

1. Частота каллусообразования (%) у райграса пастбищного ( Lolium perenne L.) и льна крупноцветкового ( Linum grandiforum L.) сорта Голубой в зависимости от концентраций 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в питательной среде ( X ± х )

2,4-Д, мг/л	Среда МС	Среда В5
	Райграс пастбищный
1	10,2±1,5
2	24,7±2,1
4	58,1±3,9
6	54,3±4,7
8	44,6±5,0
10	35,9±4,2
Лен крупноцветковый
1	10,2±0,5	30,5±2,7
2	35,0±2,3	29,4±3,6
4	40,2±4,0	56,4±7,8
6	57,1±6,0	60,0±6,1
8	75,4±8,4	53,8±5,6
10	44,0±3,3	40,2±4,2
П р и м е ч а	н и е. МС и В 5 — соответственно среда Мура-
сиге-Скуга и использовали)	Гамборга (пропуски означают .	, что среду не

саживали на среды МС и В5 с разными концентрациями 2,4-Д, в ряде случаев добавляли кинетин (2 мг/л). Оптимальными (табл. 1) оказались среды В5 2,4-Д с (6 мг/л) (60,0 %) и МС с 2,4-Д (8 мг/л) (75,4 %). В этих условиях каллус был светло-желтого, светло-зеленого цвета, средней плотности, формировался в течение 1420 сут. Также высокую частоту каллусообразования наблюдали на средах В5 с 2,4-Д (4 мг/л) (56,4 %) и МС с 2,4-Д (6 мг/л) (57,1 %) (см. табл. 1). Работы по введению в культуру клеток льна крупноцветкового в доступной научной литературе отсутствуют, поэтому были использованы данные по другим видам льна. В наших экспериментах, как и в работах других исследователей со льном-долгунцом, отмечена зависимость каллусообразования от количественного состава фитогормонов в питательной среде, в частности обнаружено усиление каллусообразования с увеличением концентрации ауксина (15).

Для регенерации растений каллус пересаживали на среды с НУК и 6-БАП (НУК — 0,1-1 мг/л; БАЛ — 1-2 мг/л). Наибольшую частоту образования морфогенного каллуса у льна крупноцветкового отмечали на среде В5 при концентрациях БАЛ — 1 мг/л и НУК — 0,1 мг/л (табл. 2). Часть каллусных клеток у льна при культивировании становились зелеными, регенерирующие каллусы формировались во 2-3-м пассаже. При получении растений-регенерантов льна-долгунца и льна масличного использовались указанные гормоны (16, 17), причем в случае со льном-долгунцом чем старше были семядольные экспланты, тем более высокие концентрации НУК требовались для побегообразования (15). При регенерации побегов на сегментах гипокотиля большинства генотипов льна масличного оптимальная концентрация для 6-БАП была в пределах 1-2 мг/л, для НУК — 0,02-0,1 мг/л (18, 19).

2. Доля каллусов с побегами (%) у льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum L.) сорта Голубой в зависимости от концентраций 6-бензиламинопурина (6-БАЛ) и а -нафтилуксусной кислоты (НУК) в питательной среде ( X ± х )

Вариант 6-БАП + НУК, мг/л	Среда МС	Среда В5
1 + 0	20,1±1,9	32,2±3,5
1 + 0,1	40,5±2,8	60,1±4,1
1 + 0,5	37,4±4,6	52,3±3,8
2 + 0,1	35,5±3,4	47,0±3,3
2 + 0,5	25,3±2,7	28,8±2,6
1 + 1,0	10,2±0,6	15,2±1,8

Л р и м е ч а н и е. МС и В 5 — соответственно среда Мурасиге-Скуга и Гамборга.

После этого растения-регенеранты пересаживали на среду МС без гормонов для культивирования и дальнейшей пересадки для укоренения (рис., А). Следует отметить, что хотя максимальное количество каллусов образовывалось на средах В5 с 2,4-Д (6 мг/л) и МС с 2,4-Д (8 мг/л), реге-96

нерационная способность в большей степени сохранялась у каллусов, полученных на среде МС с 2,4-Д (6 мг/л) и кинетином (2 мг/л).

А

Б

Регенеранты льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum L.) сорта Голубой (А) и брахикомы иберисолистной ( Brachycome iberidifolia L.) сорта Голубая неженка (Б) в условиях in vitro.

Так как работы по введению в культуру клеток брахикомы иберисолистной отсутствуют, мы использовали питательные среды МС и Гам-борга, применяемые для некоторых сложноцветных. Оптимальными для формирования каллусов из семян брахикомы иберисолистной были среды с сочетанием ауксина и цитокинина (табл. 3): среда В5 с 2,4-Д (6 мг/л) и кинетином (2 мг/л) (50,1 %), а также среда МС с 2,4-Д (6 мг/л) и кинетином (2 мг/л) (55,4 %), формировались каллусы светло-желтого цвета, средней плотности. При концентрациях 2,4-Д 1; 2 и 4 мг/л наблюдалось интенсивное прорастание семян.

3. Частота каллусообразования у брахикомы иберисолистной ( Brachycome iberidifolia L.) сорта Голубая неженка и клевера ползучего ( Trifolium repens L.) сорта Белый в зависимости от концентрации 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты (2,4-Д) и кинетина в среде В₅ ( X ± х )

Вариант 2,4-Д + кинетин,	мг/л I	Брахикома иберисолистная	Клевер ползучий
1		20,3±1,8	0
2		25,4±2,4	12,4±0,9
4		30,1±2,7	18,4±1,2
6		45,0±4,8	36,0±2,4
8		40,2±3,6	40,1±2,7
10		30,1±5,2	43,5±3,1
1 + 2		10,7±1,2	15,6±1,4
2 + 2		32,4±2,6	22,1±3,8
4 + 2		44,6±2,9	35,2±4,1
6 + 2		50,1±4,2	43,3±3,9
8 + 2		45,2±3,1	60,2±6,5
10 + 2		21,2±2,3	45,5±3,6
П р и м е ч а н и е. В 5 — среда Гамборга.

Регенеранты брахикомы иберисолистной были получены на среде 1 /₂МС с ПУК (0,1 мг/л) и 6-БАП (2 мг/л) (62,3 %) (см. рис., Б), при уменьшении концентрации 6-БАП до 1 мг/л частота образования регенерантов значительно снизилась (до 20 %). Также следует отметить, что высокой регенерационной способностью обладали каллусы, которые получили на среде В₅ с 2,4-Д (4 мг/л) и кинетином (2 мг/л) (44,6 %).

Согласно данным литературы, для введения клевера белого в культуру клеток используют модифицированную питательную среду Гамборга (10), на которой около 2/3 генотипов исходной популяции клевера образуют каллус. В наших опытах для получения каллуса клевера белого применяли среду В5 с разными концентрациями 2,4-Д, а также в сочетании 2,4-Д с кинетином (см. табл. 3). Добавление в среду кинетина позволило повысить частоту образования каллусных клеток (см. табл. 3). Оптимальной для каллусообразования (60,2 %) оказалась среда В5 с 2,4-Д (8 мг/л) и кинетином (2 мг/л).

Для получения каллусных тканей хризантемы килеватой семена высаживали на среды МС, содержащие 6-БАП, кинетин, ИУК и НУК в различных комбинациях и концентрациях. Интенсивное каллусообразова-ние наблюдали при добавлении в питательную среду 6-БАП и ИУК, наибольшее (78,2 %) — на среде МС с 6-БАП в концентрации 1 мг/л и ИУК (0,1 мг/л). Это совпадает с данными ряда работ, в которых сообщалось об усилении роста и образовании плотной ткани каллуса на средах, содержащих ИУК (20, 21). В то же время отмечалось, что при культивировании лепестков хризантемы в присутствии ИУК и 6-БАП имеет место образование рыхлой каллусной ткани, в которой не происходит дифференциация меристематических очагов, дающих начало развитию побегов (16). В нашем опыте на среде с двумя фитогормонами образовывался плотный каллус, способный к морфогенезу. Далее полученные каллусы пересаживали на среду 1 /₂МС с 6-БАП (0,5 мг/л) и через 2-3 пассажа получили морфогенные каллусы (24,8 %).

Оптимизированные питательные среды были использованы для получения каллусных культур и растений, устойчивых к меди. В зависимости от вида и сорта растения ингибирующее воздействие регистрировали уже при концентрации меди в питательной среде 10-30 мг/л, в качестве селективных были выбраны концентрации меди 20, 30 и 40 мг/л.

Таким образом, подобраны среды для каллусообразования из семян и регенерации у райграса пастбищного, льна крупноцветкового, брахико-мы иберисолистной, хризантемы килеватой и клевера белого.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    К о л е с н и к о в а Е.Г. Газоны элементы садового дизайна. М., 2010.

• 2.  3 о т о в А.А., К о б з и н А.Г., С а б и т о в Г.А. Райграс пастбищный в луговом

  кормопроизводстве. Тверь, 2007.

• 3.    С а ф и н а Н.В. Райграс пастбищный в условиях Поволжья. Мат. Всерос. школы молодых ученых и специалистов «Перспективные технологии для современного сельскохозяйственного производства». Ульяновск, 2010: 115.

• 4.    К о б з и н А.Г., Т ю л и н В.А., Т и х о м и р о в а Т.М., В а г у н и н Д.А. Урожайность пастбищных травосмесей с райграсом пастбищным. Кормопроизводство, 2011, 11: 12-13.

• 5.    П о п о в П.Л. Виды растений, применявшиеся при вирусных болезнях человека и животных: закономерности распределения в филогенетической классификационной системе. Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2008, 4(3-4): 17-64.

• 6.    Г л а д к о в Е.А. Получение растений полевицы побегоносной с комплексной устойчивостью к тяжелым металлам и засолению методами клеточной селекции. С.-х. биол., 2009, 6: 85-88.

• 7.    Г л а д к о в Е.А., Г л а д к о в а О.В. Оценка комплексной фитотоксичности тяжелых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчивостью. Биотехнология, 2007, 1: 81-86.

• 8.    А л ь - X о л а н и Х.А.М., Д о л г и х Ю.И. Определение концентрации маннита для использования в процессе клеточной селекции на устойчивость к засухе у кукурузы. Вестник РУДН, сер. Агрономия и животноводство, 2007, 1-2: 38-42.

• 9.    С т е п а н о в а А.Ю., Д о л г и х Ю.И., В а р т а п е т я н Б.Б. Получение растений пшеницы ( Triticum aestivum L.), устойчивых к корневому затоплению. Биотехнология, 2010, 3: 64-69.

• 10.    М е з е н ц е в А.В., Л ю б а в и н а Л.А. Методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro. М., 1983: 4.

• 11.    Н е с к о р о д о в Я.Б., М и ш у т н и к а Я.В., Г а п о н е н к о А.К., С к р я б и н К.Г. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника ( Helianthus annuus L.) из асептических семян как эксплантов для генетической трансформации. Биотехнология, 2007, 6: 27-33.

• 12.    Л у к а т к и н А.С., X о м у т о в а И.Н. Оптимизация условий культивирования каллусных линий Stevia rebaudiana Bertoni и перспективы их использования. В сб: Актуаль-

  ные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов. М., 2001: 251-255.

• 13.    M u r a s h i g e T., S k o o g F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-476.

• 14.    G a m b o u r g O.L., E l e v e g h D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys. Can. J. Biochem., 1968, 46: 417-421.

• 15.    Б е л о н о г о в а М.А., Р а л д у г и н а Г.Н. Регенерация побегов на семядольных эксплантах льна-долгунца ( Linum usitatissimum ) и их укоренение. Физиология растений, 2006, 53(4): 560-564.

• 16.    H j o r d i s H.S., D r e x l e r J.A., S c h e f f l e r H.E. Evaluation of putative seedspecific promoters for Linum usitatissimum . Mol. Breed., 2003, 11: 149-158.

• 17.    B a s i r a n N., A r m i t a g e P., S c o 11 R.J., D r a p p e r J. Genetic transformation of flax ( Linum usitatissimum ) by Agrobacterium tumefacience : regeneration of transformed shoots via callus phase. Plant Cell Reports, 1987, 6: 396-399.

• 18.    П о л я к о в А.В. Биотехнология в селекции льна. Тверь, 2000: 139-144.

• 19.    Ч и к р и з о в а О.Ф., П о л я к о в А.В. Эффективность использования питательных сред для массового получения трансгенных растений льна. Мат. Межд. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию ВНИИ льна «Итоги и перспективы развития селекции, семеноводства, совершенствования технологии возделывания и первичной переработки льна-долгунца». Торжок, 2000: 42-44.

• 20.    М и т ю ш к и н а Т.Ю., Д о л г о в С.В. Разработка методов регенерации и трансформации хризантем ( Chrysanthemum morifolium Ramat). В сб.: Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1993: 34.

• 21.    Г р а н д а Р. Микроклональное размножение хризантем. Известия ТСХА, 2009, 1: 146-148.

INTRODUCTION TO CELL CULTURE USED FOR OBTAINING FODDER AND DECORATIVE PLANTS RESISTANT TO STRESS

I.I. Litvinova1, E.A. Gladkov1, 2

S u m m a r y

With the aim of developing a culture method for efficient plant regeneration in vitro, the aseptically treated seeds of Lolium perenne L., Linum grandiflorum L., Brachycome iberidifolia L., Chrysanthemum carinatum L. and Trifolium repens L. were cultured on B₅ and Murashige and Skoog (MS) media, containing different combinations of plant growth regulators to induce a callus . The highest percentage of calluses of Linum grandiflorum was observed on В₅ with 2,4-D (6 mg/l) and МS with 2,4-D (6 mg/l) and kinetin (2 mg/l). In Lolium perenne L., MS with 2,4-D (4 mg/l) was used for the best callus formation. In Brachycome iberidifolia , В₅ with 2,4-D (4 mg/l) and kinetin (2 mg/l) or B₅ with 2,4-D (6 mg/l) and kinetin (2 mg/l) were the most effective conbinations. The best callus formstion for Chrysanthemum carinatum and Trifolium repens were achieved on MS supplemented with 6-BAP (1 mg/l) and IAA (0,1 1 mg/l) and В₅ enriched with 2,4-Д (8 mg/l) and kinetin (2 mg/l), respectively. MS free of phytphormones, B₅ with 6-BAP (1 mg/l) and NAA (0,1 mg/l), and 1 /₂MS with 6-BAP (2 mg/l) and NAA (0,1 mg/l) were identified as the optimal combination for plant regeneration for Lolium perenne L., Linum grandiflorum and Brachycome iberidifolia , respectively.

Вниманию читателей! Вышла в свет книга: Гладков Е.А. Биоэкология. Учебное пособие. М.: изд-во МГУИЭ, 2011, 136 с.

Рассматриваются фундаментальные проблемы экологии как биологической науки, изложены основные сведения современной экологии: экологические факторы и адаптация к ним организмов, экология популяций и сообществ, экосистемы и биосфера. Учебное пособие предназначено студентам, изучающим теоретические курсы дисциплин «Общая экология», «Экология», «Биоэкология» и обучающимся специальностям «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов», «Инженерная защита окружающей среды», «Биотехнология», бакалаврам по направлениям «Техносферная безопасность», «Биотехнология», «Экология и природопользование», «Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии».