Выделение и изучение химической структуры токсина с инсектицидной активностью из гриба Lecanicillium muscarium

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение биомассы гриба и определение инсектицидной активности

Lecanicillium muscarium (Zimmerm.) Zare & W.Gams штамм P-81 [10] выращивали на модифицированной среде с пептоном. Состав среды и условия выращивания описаны в [7]. Инсектицидную активность экстрактов определяли контактным методом путем помещения тест-насекомых (виковая тля Megoura viciae ) на фильтровальные диски, смоченные 0.1–0.5 % экстрактами. Учет смертности насекомых проводили через 2 и 4 ч.

Получение экстракта и выделение инсектицидного токсина

Сухую биомассу гриба массой 30 г экстрагировали 300 мл смеси хлороформ—метанол 2 : 1 при комнатной температуре на встряхивателе

Табл. 1. Инсектицидная активность исходного экстракта и фракций в отношении виковой тли

Название тестируемого образца	Концентрация фракции в метаноле, мг/мл	Смертность тли, %
		2 ч	4 ч
Исходный экстракт	10	43.0	55.0
Хлористометиленовая фракция	10	25.7	35.6
Ацетонитрильная фракция	10	53.5	100
Метанольная фракция	10	25.0	29.2
Контроль (вода)	—	0.0	0.0

Рис. 1. Хроматограмма ацетонитрильной фракции после первичного разделения на самплете С18

в течение 2 ч в режиме 200 об/мин дважды. Экстракт отделяли фильтрованием. Растворитель упаривали на роторном испарителе при 40 °С. Полученный сухой остаток массой 1.35 г растворяли в 135 мл хлористого метилена (10 мг/мл) и наносили на самплет С18, высушивали на воздухе, и промывали последовательно рядом растворителей: хлористым метиленом, ацетонитрилом и метанолом. После удаления растворителей проводили биооценку полученных фракций на тест-насекомых. Ацетонитрильная фракция проявила максимальную активность. 1 %-й раствор вызывал 53.5 % гибели тлей в течение 2 ч (табл. 1). Результаты анализа методом ВЭЖХ показали многокомпо-нентность этой фракции (рис. 1). Условия хроматографирования: Waters Alliance 2690, УФ-детек- тор, колонка Luna 5 мкм C18 (2) 100A (10×250) мм, ацетонитрил—вода 88 : 12; скорость потока 1 мл/мин; λ = 215 нм.

Ацетонитрильный экстракт подвергали дальнейшему фракционированию на самплете с силикагелем. Для этого сухой остаток растворяли в 5 мл ацетонитрила, наносили на самплет, высушивали на воздухе и промывали последовательно рядом растворителей: хлористым метиленом, ацетонитрилом и метанолом. Хлористометиленовая фракция в концентрации 5 мг/мл вызывала 80 % гибели тлей через 2 ч после контакта и 100 % через 4 ч. Активность ацетонитрильной фракции была в 2 раза ниже, метанольная не проявляла никакой активности. Анализ методом ВЭЖХ хлористометиленовой фракции показал

Рис. 2. Хроматограмма хлористометиленовой фракции после второй ступени очистки на самплете с силикагелем

мВ

0 ch1

Н-------------------ii1i1 2 ^-------------------i1iiiiiiiii-------------------r

2    3    4    5    6    7    8    9    10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20

мин

Рис. 3. Хроматограмма очищенного токсина после разделения методом ВЭЖХ

наличие в ней 8 компонентов (рис. 2). Дополнительную стадию хроматографического разделения с целью выделения индивидуальных активных компонентов проводили в следующих условиях: Waters Alliance 2690, УФ-детектор, колонка Luna

10 мкм Silica (2) 100A (10×250) мм, метанол, 1 мл/мин, 215 нм. Все основные фракции были проверены на инсектицидную активность, и только одна фракция показала активность. ВЭЖХ-анализ этой фракции на колонке С18 показал на- личие одного компонента с временем удерживания 15.2–15.8 мин (рис. 3). При упаривании растворителя было получено белое кристаллическое вещество игольчатой формы массой 8 мг.

Изучение химической структуры токсина

Проверка чистоты выделенного токсина и съемка предварительного масс-спектра были осуществлены на жидкостном тандемном хромато-масс-спектрометре Shimadzu LCMS-IT-TOF с системой ввода образца электроспрей (ESI), квадрупольной ионной ловушкой и времяпролетным детектором. Масс-спектры регистрировали в интервале масс m / z 100–650 Да, напряжение на детекторе составляло 1.6 кВ.

Масс-спектрометрический анализ высокого разрешения образца проводился на ионно-циклотронном масс-спектрометре Varian 902-MS MALDI MassSpectrometer (ICR FTMS) со сверхпроводящим магнитом 9.4 Тл.

Съемка ИК-спектра осуществлялась в хлороформе на приборе ФСМ 1202. УФ-спектр был снят в метаноле на приборе Ultrospec II LKB Biochrom.

Все спектры ЯМР были записаны на спектрометре Varian DirectDrive NMR System 700 МГц, оборудованном 5 мм TXI (H/C/N) датчиком. Использовались стандартные импульсные последовательности из набора библиотеки Varian ChemPack 4.1: 1Н и 13С ЯМР, DEPT, 2D-экспери-ментов (1H-1H COSY, HMBC, HSQC).

Одномерные протонные ЯМР-спектры явились результатом усреднения 128 накоплений однократных измерений 16 384 комплексных точек, а углеродные ЯМР-спектры — 2048 накоплений однократных измерений 44 000 комплексных точек. 13C ЯМР-спектры были получены при помощи импульсной последовательности с развязкой и усилением ЯЭО. Релаксационная задержка между накоплениями в одномерных экспериментах составляла 1 с. Гомоядерные COSY-спектры были получены при помощи градиентной импульсной последовательности как результат накопления 2048×256 комплексных точек; на каждый инкремент регистрировали с 8-кратным накоплением. Гетероядерные 13C-HSQC ЯМР-эксперименты были получены при помощи импульсной последовательности HSQC с редактированием мульти-плетности и развязкой во время наблюдения. Константа косвенного спин-спинового взаимодействия для пары спинов, взаимодействующих через одну химическую связь, принималась для 1H–13C равной 146 Гц. Релаксационная задержка между накоплениями в экспериментах равнялась 1 с. Для получения этих спектров было осуществлено накопление 2048×400 комплексных точек; на каждый инкремент регистрировали с 64-кратным накоплением. ЯМР-спектры HMBC были получены при помощи импульсной последовательности с подавлением гетероядерных взаимодействий через одну химическую связь. Константа косвенного дальнодействующего спин-спинового взаимодействия 1H–13C принималась 4 или 8 Гц. HMBC-спектры явились результатом накопления 2048×400 комплексных точек; на каждый инкремент регистрировали с 8-кратным накоплением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для установления химической структуры выделенного соединения была осуществлена съемка ИК, УФ, масс-спектров, а также серия ЯМР-экспе-риментов.

Изучаемое соединение не показало поглощения в УФ-спектре при λ от 240 до 290 нм, что указывает на отсутствие ароматических групп. Полоса поглощения при λ max = 218 нм может свидетельствовать о наличии в структуре одной или нескольких несопряженных двойных связей. ИК-спектр подтвердил эти данные, а также показал присутствие в структуре молекулы OH-группы.

Для разработки стратегии идентификации структуры токсина на первом этапе нами была осуществлена съемка спектров ПМР, ¹³С ЯМР и DEPT. Анализ спектра ЯМР ¹H указал на принадлежность большинства протонов исследуемого соединения к алифатическому типу. Лишь 4 протона имели химические сдвиги δ H , указывающие на их связывание с sp²-углеродными атомами: δ H = 5.14, 5.21, 6.23, 6.49 ppm (табл. 2). Это же подтвердил и спектр ЯМР ¹³C: 4 атома углерода имели химические сдвиги δ C , соответствующие кратным связям: δ C = 133.4, 134.9, 137.8, 138.1 ppm. Это может свидетельствовать о наличии в исследуемом соединении двух двойных связей. Кроме того, в спектре ЯМР ¹H присутствовал сигнал протона, соответствующего связыванию O–CH ( δ H = = 3.95 ppm). С другой стороны, в спектрах ЯМР ¹³C и DEPT отсутствовали сигналы, соответствующие углеродным атомам карбонильных и карбоксильных групп.

В дальнейшем нам необходимо было найти последовательность связывания углеродных и водородных атомов в молекуле. С этой целью была осуществлена съемка двумерных спектров ЯМР 1H—1H COSY, 13C—1H HSQC и 13C—1H HMBC. При этом спектр ЯМР 13C—1H HSQC позволил найти соответствие между углеродными атомами и связанными с ними протонами (табл. 2). Анализ кросс-пиков в спектре ЯМР 1H—1H COSY, являющихся проявлением спин-спинового взаимодействия вицинальных протонов в алифатических цепях, и 13C—1H HMBC, характеризующих дальнее (для насыщенных соединений,

Табл. 2. ¹H и ¹³C ЯМР-спектры токсина, выделенного из мицелия гриба Lecanicillium muscarium

№ атома С	δ С , ppm	δ H , ppm	Мультиплетность m H	J , Гц	n H	Группа
1	82.0	—	—	—	—	C ЧЕТВ
2	133.4	6.49	д	8.4	1	CH=
3	138.1	6.23	д	8.4	1	CH=
4	84.8	—	—	—	—	C ЧЕТВ
5	53.8	1.48	д	14.0	1	CH
6	26.0	1.20	д.д	12.6; 2.8	1	CH 2
		1.49	д.д	8.2; 14.1	1
7	42.0	1.94	д.д	8.1; 8.0	1	CH 2
		1.22	д	9.8	1
8	47.2	—	—	—	—	C ЧЕТВ
9	54.3	1.54	д.д	—	1	CH
10	23.3	1.39	д.д	11.9; 17.5	1	CH 2
		1.58	д.д	7.4; 9.1	1
11	31.3	1.34	д.д	13.3; 3.5	1	CH 2
		1.73	м	—	1
12	58.9	1.21	д.д	—	1	CH
13	15.5	0.81	с	—	3	CH 3
14	20.8	0.87	с	—	3	CH 3
15	42.3	2.01	м	7.3	1	CH
16	23.5	0.99	д	6.3	3	CH 3
17	137.8	5.14	д.д	15.4; 7.7	1	CH=
18	134.9	5.21	д.д	15.4; 7.7	1	CH=
19	45.4	1.84	д.д	14.0; 7.0; 7.0	1	CH
20	20.2	0.89	д	6.3	3	CH 3
21	35.7	1.46	д.т	14.0; 7.0	1	CH
22	22.3	0.81	д	7.0	3	CH 3
23	22.6	0.82	д	7.0	3	CH 3
1’	69.0	3.95	т.т	11.2; 5.6	1.00	CH
2’	39.6	1.90	д.д	14.0; 11.2	2	2CH 2
		2.10	д.д.д	14.0; 5.6; 1.4	2
3’	37.4	1.94	д.т	14.0; 4.9	2	2CH 2
		1.68	д.т	14.0; 3.5	2
4’	32.8	1.82	д.т	14.0; 7.0	1	CH 2
		1.52	м	—	1

как правило, через 2–3 связи) взаимодействие углеродных атомов с протонами, позволил установить последовательность связывания углеродных атомов в молекуле. Нумерации атомов в структурной формуле соединения (рис. 4) и в табл. 2 не связаны с их нумерацией в названии соединения по ИЮПАК.

Так, взаимодействие протона H21 при δ 1.46 ppm в спектре 1H—1H COSY с протонами метильных групп при δ 0.81 ppm (H22) и 0.82 ppm (H23) указывает на наличие связи между углеродным атомом при δ 35.7 ppm метиновой группы CH-21 с этими метильными группами. Кроме того, протон H21 взаимодействует с протоном другой метиновой группы СН-19 (δH 1.84 ppm), что может свидетельствовать о связывании углеродных атомов при δ 45.4 и 35.7 ppm. Аналогичным образом было доказано связывание углеродного атома С-19 при

δ 45.4 ppm с метильной группой СН 3 -20 и С-18 двойной связи через наличие спин-спинового взаимодействия протона H¹⁹ ( δ H 1.84 ppm) с тремя протонами H 20 ( δ H 0.89 ppm) метильной группы и протоном двойной связи H¹⁸ ( δ H 5.21 ppm) соответственно. Протоны двойной связи H¹⁸ ( δ H 5.21 ppm) и H¹⁷ ( δ H 5.14 ppm), проявляющиеся в виде дублета дублетов каждый, дают кросс-пик в спектре ¹H— ¹H COSY. Константа J = 15.4 Гц спин-спинового взаимодействия этих протонов, найденная из спектра ЯМР ¹H, свидетельствует о транс -конфигурации двойной связи. Протон Н¹⁵, дающий сложный мультиплетный сигнал при δ 2.01 ppm, взаимодействует с протоном H¹⁷ с константой J = 7.7 Гц, а также с протонами метильной группы СН 3 -16 при δ 0.99 ppm и метиновым протоном H¹² при δ 1.21 ppm. Таким образом, было установлено связывание группы CH-15 ( δ C 42.3 ppm) с углеродным атомом двойной связи C¹⁷ ( δ C 58.9 ppm), метильной группой CH 3 -16 и углеродным атомом C¹² ( δ C 58.9 ppm) цикла С (рис. 4).

В цикле C наблюдается слабое взаимодействие протонов H¹² ( δ H 1.21 ppm) и H¹¹ ( δ H 1.73 ppm), при этом кросс-пик между H¹² и вторым протоном с δ H 1.34 ppm группы CH 2 -11 в спектре ¹H—¹H COSY отсутствует. Однако на связывание CH 2 -11 и CH-12 указывают кросс-пики между С¹² и протонами группы CH 2 -11, а также между С¹¹ ( δ C 31.3 ppm) и H¹² в спектре ¹³C—¹H HMBC. Здесь же можно отметить взаимодействие С¹¹ с H¹⁰ ( δ H 1.39 ppm) и С¹⁰ ( δ C 23.3 ppm) с H¹¹ ( δ H 1.34 ppm). Наличие связи между группами CH 2 -11 и CH 2 -10 подтверждается кросс-пиком H¹⁰ ( δ H 1.58 ppm)—H¹¹ ( δ H 1.34 ppm) в спектре ¹H—¹H COSY. Аналогичным образом доказывается связывание CH-9—CH 2 -10 (кросс-пики H¹⁰ ( δ H 1.39 ppm)—H⁹ ( δ H 1.54 ppm), С¹⁰ ( δ C 23.3 ppm)—H⁹ ( δ H 1.54 ppm), С⁹ ( δ C 54.3 ppm)—

H¹⁰ ( δ H 1.39 ppm)), С-8—CH-12 (кросс-пик С⁸ ( δ C 47.2 ppm)—H¹² ( δ H 1.21 ppm)) и С-8—CH-9 (кросспик С⁸ ( δ C 47.2 ppm)—H⁹ ( δ H 1.54 ppm)).

Далее последовательно будут изложены данные двумерных спектров ЯМР 1H—1H COSY и 13C—1H HMBC, подтверждающие, на наш взгляд, порядок связывания в циклах A и B. С-8—CH3-13: кросспик С8 (δC 47.2 ppm)—H13 (δH 0.81 ppm). С-8— CH2-7: кросс-пик С8 (δC 47.2 ppm)—H7 (δH 1.22 ppm). CH2-7—CH2-6: кросс-пики С7 (δC 42.0 ppm)—H6 (δH 1.20 ppm), С7 (δC 42.0 ppm)—H6 (δH 1.49 ppm), С6 (δC 26.0 ppm)—H7 (δH 1.22 ppm), H6 (δH 1.20 ppm)—H7 (δH 1.94 ppm). CH2-6—CH-5: кросс-пики С5 (δC 53.8 ppm)—H6 (δH 1.20 ppm), С5 (δC 53.8 ppm)—H6 (δH 1.49 ppm), С6 (δC 26.0 ppm)— H5 (δH 1.48 ppm), H5 (δH 1.48 ppm)—H6 (δH 1.20 ppm). С-1—CH-9: кросс-пик С1 (δC 82.0 ppm)—H9 (δH 1.54 ppm). С-1—CH-5: кросспик С1 (δC 82.0 ppm)—H5 (δH 1.48 ppm). С-1—CH3-14: кросс-пик С1 (δC 82.0 ppm)—H14 (δH 0.87 ppm). В спектре 13C—1H HMBC отсутствует кросс-пик С5 (δC 53.8 ppm)—H6 (δH 1.20 ppm), однако на наличие связи С-4—CH-5 может косвенно указывать спин-спиновое взаимодействие углеродного атома C5 (δC 53.8 ppm) и протонов метильной группы CH3-14 (δH 0.87 ppm), дающей в спектре синглетный сигнал и связанной с четвертичным углеродным атомом С4 (δC 84.8 ppm). Так как каждый из углеродных атомов С4 и С1 взаимодействуют с обоими протонами двойной связи C2=C3, имеющими химические сдвиги при δH 6.23 и 6.49 ppm, это не позволяет провести точное отнесение сигналов этих атомов. Тем не менее кросс-пик углеродного атома при δC 133.4 ppm и протона H9 (δH 1.54 ppm) указывает на связывание именно атома С2 (δC 133.4 ppm) с С1 (δC 82.0 ppm).

Рис. 4. Химическая структура токсина, выделенного из Lecanicillium muscarium

Таким образом, второй углеродный атом двойной связи при δ C 138.1 ppm связан с С⁴ ( δ C 84.8 ppm). Константа спин-спинового взаимодействия H²–H³ J = 8.4 Гц указывает на цис конфигурацию двойной связи.

Обращает на себя внимание сильное разэкра-нирование четвертичных углеродных атомов С1 и C4, что можно объяснить связыванием этих атомов с атомами кислорода. Кроме того, в спектре ПМР присутствует сигнал протона H^1’ c δ H 3.95 ppm, который однозначно свидетельствует о его принадлежности к системе CH–O. Это же подтверждает химический сдвиг ( δ C 69.0) углеродного атома, с которым связан данный протон. Из спектра ¹H—¹H COSY следует, что рассматриваемый протон имеет спин-спиновое взаимодействие с протонами, имеющими δ H 2.10 и 1.90 ppm и более слабое взаимодействие с протонами при δ H 1.82 и 1.52 ppm. Первые принадлежат к группе CH 2 -2’, вторые — к CH 2 -4’. В свою очередь протон при δ H 1.90 ppm имеет слабое взаимодействие с протоном при δ H 1.68 ppm группы CH 2 -3’. Протоны групп CH 2 -3’ ( δ H 1.68 и 1.94 ppm) и CH 2 -4’ ( δ H 1.82 и 1.52 ppm) других кросс-пиков, указывающих на их взаимодействие с протонами, не образуют.

В спектре HMBC наблюдаются следующие кросс-пики. Интенсивные С1’ (δC 69.0 ppm)—H2’ (δH 1.90 ppm), С1’ (δC 69.0 ppm)—H2’ (δH 2.10 ppm) и более слабые С1’ (δC 69.0 ppm)—H3’ (δH 1.68 ppm), С1’ (δC 69.0 ppm)—H4’ (δH 1.52 ppm). Это может свидетельствовать о наличии связи между С1’ (δC 69.0 ppm) и С2’ (δC 39.6 ppm). Кросс-пик С2’ (δC 39.6 ppm)—H1’ (δH 3.95 ppm) и протон-протонные взаимодействия в спектре 1H—1H COSY подтверждают это предположение. Взаимодействия С2’ (δC 39.6 ppm)—H3’ (δH 1.68 ppm) и С2’ (δC 39.6 ppm)—H3’ (δH 1.94 ppm) в свою очередь указывают на связь С2’ (δC 39.6 ppm)—С3’ (δC 37.4 ppm). Кросс-пики С3’ (δC 37.4 ppm)—H4’ (δH 1.52 ppm) и С4’ (δC 32.8 ppm)—H3’ (δH 1.68 ppm) могут свидетельствовать о наличии связывания С3’ (δC 37.4 ppm)—С4’ (δC 32.8 ppm). Также в спектре HMBC нами были обнаружены дальние (более чем через 2 связи) взаимодействия: С4’ (δC 32.8 ppm)— H2’ (δH 2.10 ppm), С4’ (δC 32.8 ppm)—H2’ (δH 1.90 ppm), С3’ (δC 37.4 ppm)—H14 (δH 0.87 ppm), С14 (δC 20.8 ppm)—H3’ (δH 1.68 ppm), С14 (δC 20.8 ppm)—H3’ (δH 1.94 ppm), С3’ (δC 37.4 ppm)—H5 (δH 1.48 ppm), С2’ (δC 39.6 ppm)—H14 (δH 0.87 ppm), С2’ (δC 39.6 ppm)—H5 (δH 1.48 ppm), С2’ (δC 39.6 ppm)—H3 (δH 6.23 ppm), С2’ (δC 39.6 ppm)—H4 (δH 6.49 ppm), С3 (δC 138.1 ppm)—H2’ (δH 1.90 ppm), С3 (δC 138.1 ppm)—H2’ (δH 2.10 ppm). Это может указывать на пространственную сближенность этих групп. С другой стороны, сигнал H1’ представляет из себя триплет триплетов правильной формы, что указывает на симметричность структуры и его взаимодействие с двумя парами маг- нитно эквивалентных протонов.

Масс-спектр высокого разрешения не показал пика молекулярного иона, что, вероятно, связано с нестабильностью образующегося катиона. Однако в спектре наблюдался пик с массой 411.367, который мы можем отнести к иону, образующемуся из молекулярного путем отщепления молекулы воды. Это позволяет подтвердить выводы, сделанные на основе анализа ЯМР-спектров.

Таким образом, для выделенного соединения была предложена структура, представленная на рис. 4:

10-(1,4,5-триметилгекс-2-енил)-5,9-диметил-5-циклогексилокситрицикло[7.3.0.0 ^2.6 ] додец-3-ен-2-ол

ИК (CCl 4 ) 3399 ( ν OH), 2956 ( ν CH 3 ), 2926 ( ν CH 2 ), 2870 ( ν Alk), 1739 ( ν С=С), 1666 ( ν С=С), 1458 ( δ Alk), 1372 ( δ Alk), 1168, 1070 ( ν C-O), 969, 835, 726 см^–1; УФ (метанол) λ max 218 нм; MALDI MS (ICR FTMS) m/e 411.367 [M+H⁺-H 2 O].

Полученные результаты подтверждаются имеющимися в литературе данными для химических структур близкого строения [11–14]. Следует отметить, что строение колец B , C и боковой цепи, аналогичное установленному для полученного нами токсина, является характерным для многих метаболитов терпеноидной природы, продуцируемых грибами. В дальнейшем планируется изучить стереохимическое строение выделенного соединения.

Работа выполнена с использованием научного оборудования ЦКП "Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ".