Выделение, культивирование и характеристика сперматогониев петуха (Gallus gallus)

Использование клеток гонад сельскохозяйственных животных и птицы для получения трансгенных и химерных особей признано одним из перспективных направлений современной биотехнологии, рассматриваемых в качестве альтернативы традиционным методам селекции и трансгенеза (1-5). Интерес к использованию клеток семенников обусловлен их природной способностью переносить чужеродную ДНК (чДНК) в яйце-

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ ¹ 16-16-10059. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.

клетку в процессе оплодотворения. В случае интеграции чДНК в геном хозяина трансген может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращается время и затраты на получение трансгенного потомства.

В сперматогенном эпителии можно выделить два типа клеток: поддерживающие клетки (клетки Сертоли) и клетки сперматогенной линии (сперматогонии типа А и В, сперматоциты 1-го и 2-го порядка, сперматиды, спермии) (6). Наибольший интерес представляет генетическая модификация стволовых клеток гонад — сперматогониев типа А, которые служат предшественниками высокоспециализированных зрелых половых клеток самцов — спермиев. Эти клетки представляют собой немногочисленную популяцию сперматогенных клеток, располагающихся на базальной мембране семенных канальцев, и обладают способностью к самообновлению и дифференцировке, что обеспечивает непрерывность сперматогенеза с образованием спермиев (7, 8). Такие свойства сперматогониев открывают широкие возможности для реализации их потенциала при создании трансгенных и химерных особей с заданными свойствами.

В случае трансгенеза рассматриваются два подхода по доставке рекомбинантной ДНК в сперматогенные клетки семенников, в том числе в сперматогонии, — in vivo и ex vivo. В первом случае предполагается введение генных конструкций непосредственно в семенники взрослых самцов. Для этих целей используют, как правило, ретровирусные и лентивирусные векторы, которые способны самостоятельно интегрироваться в геном клетки-хозяина и трансформировать клетки-мишени с высокой эффективностью (9, 10). При введении рекомбинантной ДНК в сперматогенные клетки ex vivo выполняют трансформацию сперматогониев in vitro с последующей трансплантацией в семенники стерильных самцов-реципиентов и получением трансгенной спермы, которая затем используется для осеменения самок с целью рождения трансгенного потомства (11, 12).

Один из ключевых факторов, обеспечивающих результативность этой технологии, — получение культуры сперматогониев. Культивирование и генетическая трансформация сперматогенных клеток самцов in vitro значительно расширяют спектр подходов по доставке рекомбинантной ДНК в клетки-мишени с помощью безопасных систем, позволяют целенаправленно воздействовать на конкретные клетки-мишени. При этом риски появления трансгенных особей-мозаиков с нетрансформированными половыми клетками, от которых в дальнейшем не удается получить трансгенное потомство, полностью нивелируются. Применение позитивной и негативной селекции при модификации половых клеток гарантирует наличие в оплодотворенном ооците единственной копии трансгена, встроенной в определенный локус, и сохранение целостности остального генома. С учетом этого искусственное осеменение трансформированными спермиями в будущем может рассматриваться как элемент программ по массовому получению генетически модифицированной птицы.

Уже выделены и охарактеризованы сперматогонии лабораторных животных — мышей (13, 14) и хомячков (15), некоторых видов сельскохозяйственных животных — свиней (16-20) и коз (21, 22), а также рыб (23). Сообщается о выделении сперматогониев из гонад эмбрионов и семенников 1-суточных цыплят (24, 25).

Ранее нами изучена возрастная динамика сперматогенеза у птицы и показано, что у петушков в возрасте до 5 нед в семенниках среди клеточных популяций превалируют сперматогонии (26). В настоящем исследовании мы показали, что высокую чистоту культуры клеток сперматого- ниев обеспечивает предварительное удаление других типов клеток, в частности самой многочисленной популяции клеток Сертоли. Оставшиеся в клеточной суспензии единичные соматические клетки образуют фидерный слой. Оптимальными свойствами обладает фидерный слой, сформированный собственными клетками Сертоли.

Наша цель заключалась в оптимизации приемов выделения и культивирования сперматогониев петуха в рамках поэтапной разработки технологии получения трансгенной птицы.

Методика. Семенники, изъятые у 2-недельных петухов, обрабатывали 70 % этиловым спиртом, декапсулировали и дважды промывали в физиологическом растворе с двойной дозой антимикотического антибиотика, затем механически измельчали до фрагментов размером 1-2 мм и трижды промывали средой DMEM (среда Игла в модификации Дюльбек-ко), осаждая клетки (300 g, 7 мин) с последующим пипетированием суспензии. Полученную в результате механической обработки клеточную массу подвергали ферментативной обработке: к полученному осадку клеток добавляли раствор коллагеназы («ПанЭко», Россия) в DMEM (конечная концентрация 1 мг/мл) и инкубировали в течение 20 мин при 37 ° С. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием (200 g, 5 мин), надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 0,25 % раствор трипсина («Invitrogen», США), пипетировали и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С, периодически встряхивая. После нейтрализации трипсина средой с сывороткой плода крупного рогатого скота (КРС) («GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories», США) клетки осаждали, промывали несколько раз, повторно осаждая и пипетируя образовавшийся осадок в ростовой среде. Полученную суспензию высевали в культуральные флаконы (1 x 10 6 кл/см²). В качестве ростовой использовали среду DMEM HG («Invitrogen», США) с содержанием глюкозы 4,5 г/л, дополненную 20 % сыворотки плода КРС, а -глутамином (2 мМ; «Invitrogen», США), МЕМ (Minimum Essential Medium, 100 x ; «Invitrogen», США), антимикотическим антибиотиком (100 x ; «Invitrogen», США). Клетки снимали с субстрата с помощью 0,25 % раствора трипсина.

С целью получения первичной культуры клеток Сертоли для дальнейшего использования в качестве фидерного слоя через 24 ч после выделения первичной культуры сперматогониев ростовую среду, содержащую клетки сперматогенного ряда и очень небольшое количество не прикрепившихся к субстрату соматических клеток, сливали. Чашки промывали средой DMEM, после чего к прикрепившимся клеткам, представленным в основном клетками Сертоли и фибробластами, добавляли среду DMEM HG для дальнейшего культивирования. Поскольку указанная среда не оптимальна для роста фибробластов, они постепенно вытеснялись из культуры. Для приготовления фидерных слоев клетки после достижения 90 % монослоя в течение 3 ч обрабатывали раствором митомицина С («Sigma-Aldrich Сo.», США) в конечной концентрации 30 мкг/мл, после чего трижды промывали раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия) и использовали для культивирования сперматогониев. Для идентификации клеток Сертоли их фиксировали метанолом и окрашивали жировым красным О (Oil red) в течение 15 мин.

Ростовой средой для сперматогониев служила DMEM HG, дополненная 5 % сыворотк ой плода КРС, а -глутамином (2 мМ), МЕМ (10 мкл/мл), антибиотиком (100 x ), меркаптоэтанолом (5 x 10^-5 М; « Invitrogen», США), альбумином (5 мг/мл; «Invitrogen», США), DL-lactic acid (1 мкл/мл; «Sigma-Aldrich Сo.», США), EGF (epidermal growth factor, 20 нг/мл; «Sigma-

Aldrich Сo.», США), bFGF (basic fibroblast growth factor, 10 нг/мл; «Sigma-Aldrich Сo.», США) и LIF (leukemia inhibitory factor, 2 нг/мл; «Sigma-Al-drich Сo.», США). Среду меняли каждые 3 сут.

Морфологическую оценку свежевыделенной популяции спермато-генных клеток петуха проводили визуально под фазово-контрастным микроскопом («Nikon», Япония). Для получения постоянных препаратов спер-матогенные клетки окрашивали по Романовскому-Гимзе: клетки 10 мин фиксировали охлажденным до - 20 ° С метанолом, промывали дистиллированной водой и помещали в краситель Гимзы («Merck», Германия) на 1015 мин, после чего промывали водопроводной водой.

Для идентификации сперматогониев в культуре на 7-е сут культивирования применяли гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание. При гистохимическом окрашивании по Шиффу (на гликоген) по стандартной методике (27) клетки фиксировали 10 % нейтральным забу-ференным формалином. В результате колонии сперматогониев окрашивались в малиновый цвет. Для выявления экспрессии поверхностных антигенов SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1) клетки фиксировали метанолом. Иммуногистохимическую обработку проводили с использованием авидин-биотиновой системы («Vector Laboratories», США) согласно описанию (15). В качестве первых антител использовали анти-SSEA-1. Комплекс антиген-антитело идентифицировали с помощью пероксидазы, для выявления которой применяли 3,3-диаминобензидин-тетрахлорат (ДАБ) («Vector Laboratories», США).

Результаты. Стадии выделения сперматогониев показаны на рисунке 1 (А-Г).

А

В

Рис. 1. Стадии выделения сперматогониев из семенника 2-недельного петуха ( Gallus gallus ): А — после механической обработки, видны небольшие фрагменты ткани семенника (нативный препарат, увеличение х 200); Б — после ферментативной обработки, видны обособленные сперматогенные и соматические клетки (нативный препарат, увеличение х 400); В — 2-суточная культура, видны сперматогонии (1), клетки Сертоли (2), клетки Лейдига (3), фибробласты (4), миоидные клетки (5) (нативный препарат, увеличение х 400); Г — 2-суточная культура, сперматогонии отмечены стрелками (окрашивание по Романовскому-Гимзе, увеличение х 400). Световая (А, Б, Г) и фазово-контрастная (В) микроскопия («Nikon», Япония).

После механической обработки семенника на препаратах были видны небольшие фрагменты ткани (см. рис. 1, А). В результате последующей ферментативной обработки (см. рис. 1, Б) получили клеточную суспензию, состоящую преимущественно из обособленных клеток. Через 24 ч культивирования клетки соматического ряда, обладающие высокой адгезией к пластику, прикреплялись и начинали делиться. Основная часть клеток сперматогенного ряда, которые имели вид шарообразных образований, находилась во взвешенном состоянии, и только некоторые прикреплялись к распластавшимся соматическим клеткам, используя их в качестве фидерного слоя. На 2-е сут (см. рис. 1, Г) сперматогенные клетки прикреплялись к фидерному слою и приобретали округлую форму.

Анализ фиксированных препаратов выявил наличие в полученной клеточной популяции нескольких типов клеток. Многочисленную группу составляли сперматогонии и клетки Сертоли. Сперматогонии характеризовались округлой формой. На окрашенных фиксированных препаратах выявлялось крупное сферическое ядро и узкий ободок цитоплазмы. Клетки Сертоли имели крупное ядро и нечеткую цитоплазму размытой формы с липидными включениями. Наряду со сперматогониями и клетками Сертоли выявлялись клетки интерстициальной ткани — фибробласты и клетки Лейдига. Клетки Лейдига имели неправильную форму и большие размеры по сравнению с другими типами клеток семенника. Фибробласты характеризовались веретенообразной формой. Встречались также мелкие сферические миоидные клетки (см. рис. 1, В).

А

Б

В

Рис. 2. Первичная культура соматических клеток семенника петуха ( Gallus gallus ): А — 4-суточная культура, отмечается наличие фибробластов (1) и клеток Сертоли (2) (нативный препарат, увеличение х 200); Б — 7-суточная культура, наличие клеток Сертоли (2) (нативный препарат, увеличение х 200); В — 7-суточная культура, представлена клетками Сертоли (окрашивание по Романовскому-Гимзе, увеличение х 100); Г — 7-суточная культура, идентификация клеток Сертоли по наличию липидных включений (3) (окрашивание Oil red, увеличение х 400). Световая микроскопия («Nikon», Япония).

Г

С целью получения гомогенной культуры клеток Сертоли для дальнейшего использования в качестве фидерного слоя проводили культивирование соматических клеток. На 3-и-4-е сут (рис. 2, А) в культуре наблюдались клетки, различающиеся по морфологии: клетки Сертоли, по форме сходные с эпителиальными, и фибробласты, имеющие веретенообразную форму. На 6-7-е сут культивирования клетки Сертоли вытесняли все остальные (см. рис. 2, Б). На препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе, клетки в популяции имели морфологию, подобную таковой у эпителиальных клеток, и липидные включения, характерные для клеток Сертоли (см. рис. 2, Г).

Для получения максимально чистой популяции сперматогониев использовали метод, основанный на неодинаковых адгезивных способностях разных типов клеток. С этой целью с 1-суточной первичной культуры клеток семенника петуха сливали ростовую среду, содержащую не прикрепившиеся клетки, и осаждали их центрифугированием. Полученный осадок состоял в основном из клеток сперматогенного ряда, так как практически все соматические клетки, обладая по сравнению со сперматого-ниями более высокой адгезией к пластику, оставались в культуральном флаконе. Клетки пипетировали в ростовой среде для культивирования сперматогониев и высевали на фидерные слои, которыми служили клеточная линия STO, перевиваемые клетки Сертоли свиней (ПТП ) , клеточная линия Sc и первичные клетки Сертоли петуха, или на чашки, покрытые 0,2 % желатином. Наилучшие результаты были получены при использовании первичных клеток Сертоли (табл.).

Эффективность культивирования сперматогониев петуха ( Gallus gallus ) в зависимости от фидерного слоя

Показатель	Фидерный слой
	клеточная линия STO	клеточная линия Sc	перевиваемые клетки Сертоли свиней (ПТП )	первичные клетки Сертоли петуха
Прикрепление сперматогониев к клеткам фидерного слоя                         На 1-2-е сут На 1-2-е сут На 1-2-е сут       На 1-2 сут Образование колоний сперматогониев    На 4-5-е сут На 4-5-е сут На 4-е сут         На 3-и сут Сперматогониев на 7-е сут культивирования колонии (среднее для 20 колоний), шт.           6           6              8                  10

На 3-и-4 сут в культуре формировались колонии сперматогониев, постепенно увеличиваясь в размерах к 7-м сут. При использовании в качестве фидерного слоя желатина сперматогонии прикреплялись на соматические клетки, которые, как уже отмечалось, в небольшом количестве присутствовали в суспензии клеток после сбора ростовой среды с 1-суточной культуры семенников петуха (рис. 3, А, Б).

Наличие колоний сперматогониев на препаратах 7-суточной культуры подтвердило иммуногистохимическое окрашивание на SSEA-1 — маркер стволовых клеток, к которым относят сперматогонии типа А (см. рис. 3, В, Г), а также гистохимическое окрашивание на гликоген с использованием реактива Шиффа (см. рис. 3, Д, Е).

Рис. 3. Колонии сперматогониев петуха ( Gallus gallus ) (показаны стрелками) при культивировании на разных фидерных слоях: А — на собственных клетках Сертоли (окрашивание по Романовскому-Гимзе), Б — на чашках Петри, обработанных 0,2 % желатином (нативный препарат), В — наличие специфического иммуногистохимического окрашивания на экспрессию SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1), Г — отсутствие специфического иммуногистохимического окрашивания на экспрессию SSEA-1 в контроле (без использования анти-SSEA-1), увеличение х 400; Д — окрашивание колонии по Шиффу, Е — отсутствие специфического окрашивания по Шиффу в контроле (фидерный слой), увеличение х 630. Световая микроскопия («Nikon», Япония).

Таким образом, эффективность получения максимально однородной культуры сперматогониев петуха зависит от метода их отделения от других клеток и используемого фидерного слоя. Разделение клеток по способности к адгезии позволяет максимально очистить культуру сперма-тогониев от остальных клеток, в частности от самой многочисленной популяции клеток Сертоли. Единичные соматические клетки, оставшиеся после этого в клеточной суспензии, при последующем культивировании служат фидерным слоем, на который прикрепляются сперматогонии. Культивирование сперматогониев на фидерных слоях или чашках, обработанных 0,2 % желатином, с использованием соответствующей ростовой среды позволяет получать колонии сперматогониев на 3-и-4-е сут. Оптимальный фидерный слой для культивирования сперматогониев петуха формируется из собственных клеток Сертоли.