Выявление антител, специфичных к энтеротоксинам стафилококков, в сыворотке крови и молозиве коров

Мастит коров — основная причина экономических потерь в производстве молока во всем мире (1). Заболевание может быть вызвано 137 различными микроорганизмами (2), при этом наиболее часто с ним связывают Staphylococcus aureus , который выявляется как при субклинических, так и хронических инфекциях (3-5). Эффективность лечения мастита, вызываемого стафилококками, с помощью антибиотиков низкая (6) из-за ан-тибиотикорезистентности штаммов, способности S. aureus образовывать биопленки, а также выживать в эпителиальных клетках и макрофагах (7). Иммунные факторы молозива, молока и крови играют важную роль в естественном иммунитете и защите от мастита (8), однако S. aureus выделяет факторы вирулентности, способные подавлять иммунную систему организма хозяина, — энтеротоксины (SE) и токсин синдрома токсического шока (TSST-1) (9, 10), порообразующие токсины (11), фенолрастворимые моду-лины (12). Наиболее важная роль в подавлении иммунной системы хозяина и развитии мастита принадлежит энтеротоксинам. Способностью микроорганизмов продуцировать факторы, регулирующие иммунитет животных, обусловлен интерес к иммунологическим средствам предупреждения заболевания (13). Разработаны вакцины против мастита (14, 15), но вакцина-

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект ¹ 15-16-00020).

ция не обеспечивает 100 % защиты. В этой связи важны сведения о состоянии иммунитета и наличии антител к патогенам, снимающих его напряженность. Антитела класса G могут переноситься из крови в другие биологические жидкости и ткани (16), тогда как продукция IgA носит локальный характер и отражает состояние воспалительных процессов в месте секреции (17). Антитела способны предотвращать размножение микробов и нейтрализовать токсины (18), а при переносе с молозивом и молоком от матери к новорожденному служат факторами пассивной вакцинации.

Комплексная оценка иммунного статуса животных в России в связи с инфицированностью S. aureus не проводилась. Мы впервые показали наличие в биологических жидкостях у коров голштинизированной чернопестрой породы антител сразу к нескольким токсинам этого патогена.

Нашей целью было выявление и определение титров антител, специфичных к наиболее распространенным энтеротоксинам стафилококков A, B, C, D, E, G, H, I и TSST, в сыворотке крови и молозиве коров.

Методика . Исследовали пробы сыворотки крови, молозива и молока от коров ( Bos taurus taurus ) голштинизированной черно-пестрой породы второй лактации ( n = 47, 2016 год). Животные находились на беспривязном содержании в хозяйстве Калужской области и 2 раза в год подвергались иммунизации вакциной Mastivak («Laboratorios Ovejero S.A.», Испания). В состав вакцины входили Streptococcus agalactiae , S. dysgalactiae , S. uberis , S. pyogenes , Staphylococcus aureus , Arcanobacterium pyogenes , Escherichia coli (штаммы Bov-10, Bov-14, Bov-15, Bov-21, J5). Энтеротоксины стафилококков были получены, как описано ранее (19), стафилококковый энтеротоксин H (SEH) — в ФГБУ ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Кровь отбирали из хвостовой вены в вакуумные пробирки с Clot Activator и центрифугировали для осаждения форменных элементов, молозиво и молоко — непосредственно после доения со всех долей вымени в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики. Образцы для анализа доставляли в термоконтейнерах при +4 °С в течение 2 ч либо в замороженном состоянии.

Наличие и титр IgG к энтеротоксинам A, B, C, D, E, G, H, I и TSST стафилококков в сыворотке крови определяли методом непрямого иммуно-ферментного анализа. Использовали 96-луночные планшеты («Corning», США). На иммунопланшеты сорбировали индивидуальные энтеротоксины в концентрации 2 мкг/мл, растворенные в карбонатном буфере (0,1 М NaHCO₃, 0,1 М Na₂CO_3, pH 9,0) по 50 мкл на лунку. Свободные сайты лунок иммунопланшета блокировали 2 % раствором бычьего сывороточного альбумина. Сыворотку крови титровали от разведения 1:100 с дальнейшим двукратным разведением в фосфатно-солевым буфером PBST (30 мМ KCl, 1 мМ KH 2 PO 4 , 1,38 M NaCl, 160 мМ Na 2 HPO4, pH 7,5 с добавлением 0,1 % Tween 20). Положительным контролем служили моноклональные антитела мыши к энтеротоксинам (20). Для идентификации сигнала использовали конъюгат антител кролика, специфичных к IgG коров, с пероксидазой хрена («Sigma», USA). Инкубацию на каждой стадии ИФА проводилю в течение 1 ч при 37 °С. После каждой инкубации, лунки промывали раствором PBST. Реакцию проявляли с помощью ортофенилендиамина (0,4 мг/мл) в цитрат-фосфатном буфере (1,1 мМ Na₂HPO₄, 0,51 % лимонная кислота, pH 5 с добавлением 0,03 % H₂O₂)_. Реакцию пероксидазы с субстратом останавливали добавлением равного объема 10 % серной кислоты. Оптическую плотность определяли на планшетном фотометре при X = 490 нм («Bio-Rad», США).

Определение наличия и титра IgА к энтероткосинам в молозиве и молоке осуществляли как описано выше для сывороток крови. IgA к токсинам детектировали с использованием антител козы, специфичных к IgА коров и конъюгированных с пероксидазой хрена («Abcam», США). За титр антител принимали максимальное разведение сыворотки (молозива), при котором ОD490 превышало фоновое значение сигнала в 2 раза.

Измерения проводились в 3 повторностях. При статистической обработке рассчитывали средние ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Энтеротоксин SEH был выявлен в сыворотке крови у 53,19 % исследованных коров. Необходимо отметить его важное значение в патогенезе мастита и способность вызывать апоптоз эпителиальных клеток молочной железы у коров (21). SEH-продуцирующие штаммы стафилококков составляют треть от выделенных у больных маститом овец (22). На территории РФ у больных маститом животных не обнаруживалось стафилококков — носителей гена seh , однако присутствие специфических антител говорит о том, что животные могли иметь контакт со стафилококками, продуцирующими SEH. Высокое содержание в сыворотке крови антител против SEA было выявлено у 42,55 %, SEC — у 36,17 % коров, что согласуется с результатами других исследований (23). Антитела к SEB, SED, SEE, SEG, SEI и TSST были обнаружены соответственно у 10,64; 23,47; 31,91; 29,78; 34,04 и 4,26 % животных.

Самое низкое содержание антител в сыворотке крови наблюдалось к TSST (рис.), что может быть связано с тем, что он редко встречается и играет незначительную роль в развитии мастита у коров (24). В молозиве коров, как и в сыворотке крови, присутствовали антитела с высоким титром к SEH, а также к SEG и SEI (см. рис). IgA к энтеротоксинам SEG встречались у 48,93, SEH — у 53,19, SEI — у 42,56 % животных. IgA к SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST обнаружены не были.

Кратность разведения, -1g

Типичные кривые титрования cыворотки крови (А, образец ¹ 7) и молозива (Б, образец ¹ 10) на наличие энтеротоксина H (1) , энтеротоксина A (2) и энтеротоксина TSST (3) у коров голштинизированной черно-пестрой породы (каждое измерение выполнено в 3 биохимических повторностях; Калужская обл., 2016 год).

Гены, кодирующие энтеротоксины SEG и SEI, находятся в геноме стафилококков и имеют низкую степень экспрессии по сравнению с генами токсинов-суперантигенов (25), локализованными в фагах или плазмидах (25). Сообщалось, что совместное присутствие seg и sei наблюдается в изолятах S. aureus , выделенных из молока больных животных (21). Наличие IgA к энтеротоксинам в молозиве может играть существенную профилактическую роль в случае инфицирования животных стафилококками — продуцентами таких энтеротоксинов (25).

В сыворотках крови и молозиве коров титр антител к SEH находился в пределах 1:800-1:3200, для SEG и SEI — в пределах 1:800-1:1600.

Самый низкий титр антител был выявлен для TSST и SEB (соответственно 1:400 и 1:800).

В процессе исследования проб молока не удалось получить достоверных результатов по наличию в образцах антител к энтеротоксинам.

Таким образом, мы установили наличие в сыворотке крови и молозиве у клинически здоровых коров голштинизированной черно-пестрой породы антител к широкому спектру стафилококковых энтеротоксинов SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI и TSST, что свидетельствует о том, что животные могли иметь контакт со стафилококками, продуцирующими такие типы токсинов. Отсутствие антител в молоке, может говорить об их низкой концентрации в образцах.