Выявление Pasteurella multocida и генотипирование пяти ее капсульных групп при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Автор: Нефедченко А.В., Шиков А.Н., Глотов А.Г., Глотова Т.И., Терновой В.А., Максютов Р.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Проблемы диагностики инфекционных агентов
Статья в выпуске: 2 т.52, 2017 года.
Бесплатный доступ
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота причиняют значительный экономический ущерб животноводству. В этиологии этих болезней существенная роль принадлежит бактерии Pasteurella multocida, у которой выявлено 5 капсульных групп (A, B, D, E, F), имеющих разное эпизоотологическое значение. Идентификация бактерий, основанная на результатах изучения их культурально-морфологических и биохимических свойств, - трудоемкий и длительный процесс. Методы молекулярной биологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют быстро обнаружить и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах. Целью нашего исследования стала разработка и изучение эффективности мультиплексной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени для выявления культур Pasteurella multocida и генотипирования пяти капсульных групп (A, B, D, E, F). В работе использовали референтные штаммы P. multocida (1231, 681 и Т80), культуры бактерий, выделенные от больных животных в 2013-2014 годах, а также 260 проб биоматериала (легкие, селезенка, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы), отобранных от павших телят в возрасте от 4 сут до 6 мес с признаками респираторных болезней. Олигонуклеотидные праймеры и зонды были разработаны на высококонсервативный ген кmt1 и гены локуса капсульного синтеза (hyaD, fcbD, dcbF, bcbD и ecbJ ), специфичные для капсульных групп. Для проверки чувствительности реакции использовали разработанные положительные контрольные образцы и суспензии культур референтных штаммов и изолятов. Специфичность реакции подтверждали секвенированием ампликонов. Чувствительность выявления ДНК бактерии для разных групп составила от 1,6·10 до 5,9·102 геномных эквивалентов на реакцию, неспецифических реакций не наблюдали. Диагностическая чувствительность разработанного метода составила при исследовании чистых культур 103 КОЕ/мл, при исследовании биологического материала - 105 КОЕ/г. Методом ПЦР типировали 11 культур бактерий, ранее охарактеризованных серологически и бактериологически, относящихся к капсульным группам А, В и D. Анализ последовательности гена kmt1 подтвердил результаты ПЦР. При исследовании 260 проб биоматериала от больных животных обнаружили Pasteurella multocida в 63,3 % проб легких, 42,6 % - лимфатических узлов, 8,8 % - селезенки. Не установлена циркуляция среди восприимчивого поголовья животных бактерии Pasteurella multocida генотипов В и Е. В большинстве исследованных проб были выявлены генотипы А, реже - D, в одном случае - F.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, гены, капсульные группы
Короткий адрес: https://sciup.org/142214038
IDR: 142214038 | УДК: 619:579.843.95:616-078 | DOI: 10.15389/agrobiology.2017.2.401rus
Detection and genotyping Pasteurella multocida of five capsular groups in real time polymerase chain reaction
Respiratory diseases in calves cause significant economic losses in livestock. Bacterium Pasteurella multocida plays important role in the etiology of these diseases. It is known that five identified P. multocida capsular groups (A, B, D, E and F) differently affect animal epizooty. Identification of bacteria based on the cultural, morphological, biochemical properties is very labor-intensive and time-consuming. Molecular biology techniques, in particular, the polymerase chain reaction (PCR), quickly detect and identify microorganisms directly in samples of biological material, mixed or pure cultures. In this regard, the purpose of our research was to develop multiplex real-time PCR for the detection, genotyping and discrimination of five P. multocida capsular groups (A, B, D, E and F) in cattle. The target primers and probes to the highly conserved gene kmt1 and the genes in the loci of capsule synthesis ( hyaD, fcbD, dcbF, bcbD and ecbJ ) specific to the capsular groups have been designed. The sensitivity of DNA detection for different bacterial groups ranged from 1.6·10 to 5.9·102 genomic equivalents per reaction, non-specific reactions were not observed. The diagnostic sensitivity of the test was 103 CFU/ml for pure cultures and 105 CFU/g for biological material. The developed PCR protocol allowed us to type 11 bacterial cultures which were previously characterized serologically and bacteriologically and related to capsular groups A, B, and D. The kmt1 gene sequencing confirmed the results of PCR analysis. PCR analysis of 260 samples from died calves detected P. multocida in lung (63.3 %), the lymph nodes (42.6 %), and spleen (8.8 %). We did not revealed the circulation of P. multocida В and E capsular groups among the tested livestock, the majority of the samples contained P. multocida group A, in some cases, there was group D, and, in one case, group F.
Список литературы Выявление Pasteurella multocida и генотипирование пяти ее капсульных групп при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
- Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Anim. Health. Res. Rev., 2007, 8(2): 129-150 ( ) DOI: 10.1017/S1466252307001399
- Rimler R.B., Rhoades K.R. Pasteurella multocida. In: Pasteurella and pasteurellosis/C. Adlam, J.M. Rutter (eds.). Academic Press Limited, London, 1989.
- Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В., Ветров Г.В., Сергеев А.Н. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария, 2002, 3: 17-21. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=22435011. Без даты.
- Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Котенева С.В., Будулов Н.Р., Кунгурцева О.В. Этиологическая структура массовых респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах, занимающихся производством молока. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2008, 3: 72-78. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=9899939. Без даты.
- Шибаев М.А., Дудников С.А., Прохватилова Л.Б. Выявление Pasteurella multocida у крупного рогатого скота в Центральном Федеральном округе: клинико-эпизоотологическая оценка. Ветеринарная патология, 2009, 4: 50-55 Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=16769773. Без даты.
- Taylor J.D., Fulton R.W., Dabo S.M., Lehenbauer T.W., Confer A.W. Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease. J. Vet. Diagn. Invest., 2010, 22(3): 366-375 ( ) DOI: 10.1177/104063871002200304
- Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2012, 361: 1-22 ( ) DOI: 10.1007/82_2012_216
- Haemorrhagic septicaemia, Chapter 2.4.12. In: Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. 7 Edition. OIE, 2012: 732-744.
- Терентьева Т.Е., Глотова Т.И., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Сравнительная эффективность различных методов диагностики болезней крупного рогатого скота, вызываемых бактерией Pasteurella multocida. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2014, 3: 90-95. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=21732890. Без даты.
- Townsend K.M., Frost A.J., Lee C.W., Papadimitrious J.M., Dawkins H.J. Development of PCR assays for species and type specific identification of Pasteurella multocida isolates. J. Clin. Microbiol., 1998, 36(4): 1096-1100.
- Dziva F., Muhairwa A., Bisgaard M., Christensen H. Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida. Vet. Microbiol., 2008, 128(1-2): 1-22 ( ) DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.10.018
- Adhikary S., Bisgaard M., Foster G., Kiessling N., Fahlén A.R., Olsen J.E., Christensen H. Comparative study of PCR methods to detect Pasteurella multocida. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., 2013, 126(9-10): 415-22.
- Petersen A., Bisgaard M., Townsend K., Christensen H. MLST typing of Pasteurella multocida associated with hemorrhagic septicemia and development of a real-time PCR specific for hemorrhagic septicemia associated isolates. Vet. Microbiol., 2014, 170(3-4): 335-341 ( ) DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.02.022
- Townsend K.M., Boyce J.D., Chung J.Y., Frost A.J., Adler B. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol., 2001, 39(3): 924-929 ( ) DOI: 10.1128/JCM.39.3.924-929.2001
- Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Терентьева Т.Е. Типирование культур бактерии Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи ПЦР. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2013, 2: 88-93 Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=19080328. Без даты.
