Выявление Pasteurella multocida и генотипирование пяти ее капсульных групп при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Автор: Нефедченко А.В., Шиков А.Н., Глотов А.Г., Глотова Т.И., Терновой В.А., Максютов Р.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Рубрика: Проблемы диагностики инфекционных агентов

Статья в выпуске: 2 т.52, 2017 года.

Бесплатный доступ

Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота причиняют значительный экономический ущерб животноводству. В этиологии этих болезней существенная роль принадлежит бактерии Pasteurella multocida, у которой выявлено 5 капсульных групп (A, B, D, E, F), имеющих разное эпизоотологическое значение. Идентификация бактерий, основанная на результатах изучения их культурально-морфологических и биохимических свойств, - трудоемкий и длительный процесс. Методы молекулярной биологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют быстро обнаружить и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах. Целью нашего исследования стала разработка и изучение эффективности мультиплексной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени для выявления культур Pasteurella multocida и генотипирования пяти капсульных групп (A, B, D, E, F). В работе использовали референтные штаммы P. multocida (1231, 681 и Т80), культуры бактерий, выделенные от больных животных в 2013-2014 годах, а также 260 проб биоматериала (легкие, селезенка, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы), отобранных от павших телят в возрасте от 4 сут до 6 мес с признаками респираторных болезней. Олигонуклеотидные праймеры и зонды были разработаны на высококонсервативный ген кmt1 и гены локуса капсульного синтеза (hyaD, fcbD, dcbF, bcbD и ecbJ ), специфичные для капсульных групп. Для проверки чувствительности реакции использовали разработанные положительные контрольные образцы и суспензии культур референтных штаммов и изолятов. Специфичность реакции подтверждали секвенированием ампликонов. Чувствительность выявления ДНК бактерии для разных групп составила от 1,6·10 до 5,9·102 геномных эквивалентов на реакцию, неспецифических реакций не наблюдали. Диагностическая чувствительность разработанного метода составила при исследовании чистых культур 103 КОЕ/мл, при исследовании биологического материала - 105 КОЕ/г. Методом ПЦР типировали 11 культур бактерий, ранее охарактеризованных серологически и бактериологически, относящихся к капсульным группам А, В и D. Анализ последовательности гена kmt1 подтвердил результаты ПЦР. При исследовании 260 проб биоматериала от больных животных обнаружили Pasteurella multocida в 63,3 % проб легких, 42,6 % - лимфатических узлов, 8,8 % - селезенки. Не установлена циркуляция среди восприимчивого поголовья животных бактерии Pasteurella multocida генотипов В и Е. В большинстве исследованных проб были выявлены генотипы А, реже - D, в одном случае - F.

Еще

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, гены, капсульные группы

Короткий адрес: https://sciup.org/142214038

IDR: 142214038   |   DOI: 10.15389/agrobiology.2017.2.401rus

Список литературы Выявление Pasteurella multocida и генотипирование пяти ее капсульных групп при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

  • Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Anim. Health. Res. Rev., 2007, 8(2): 129-150 ( ) DOI: 10.1017/S1466252307001399
  • Rimler R.B., Rhoades K.R. Pasteurella multocida. In: Pasteurella and pasteurellosis/C. Adlam, J.M. Rutter (eds.). Academic Press Limited, London, 1989.
  • Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В., Ветров Г.В., Сергеев А.Н. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария, 2002, 3: 17-21. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=22435011. Без даты.
  • Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Котенева С.В., Будулов Н.Р., Кунгурцева О.В. Этиологическая структура массовых респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах, занимающихся производством молока. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2008, 3: 72-78. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=9899939. Без даты.
  • Шибаев М.А., Дудников С.А., Прохватилова Л.Б. Выявление Pasteurella multocida у крупного рогатого скота в Центральном Федеральном округе: клинико-эпизоотологическая оценка. Ветеринарная патология, 2009, 4: 50-55 Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=16769773. Без даты.
  • Taylor J.D., Fulton R.W., Dabo S.M., Lehenbauer T.W., Confer A.W. Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease. J. Vet. Diagn. Invest., 2010, 22(3): 366-375 ( ) DOI: 10.1177/104063871002200304
  • Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2012, 361: 1-22 ( ) DOI: 10.1007/82_2012_216
  • Haemorrhagic septicaemia, Chapter 2.4.12. In: Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. 7 Edition. OIE, 2012: 732-744.
  • Терентьева Т.Е., Глотова Т.И., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Сравнительная эффективность различных методов диагностики болезней крупного рогатого скота, вызываемых бактерией Pasteurella multocida. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2014, 3: 90-95. Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=21732890. Без даты.
  • Townsend K.M., Frost A.J., Lee C.W., Papadimitrious J.M., Dawkins H.J. Development of PCR assays for species and type specific identification of Pasteurella multocida isolates. J. Clin. Microbiol., 1998, 36(4): 1096-1100.
  • Dziva F., Muhairwa A., Bisgaard M., Christensen H. Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida. Vet. Microbiol., 2008, 128(1-2): 1-22 ( ) DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.10.018
  • Adhikary S., Bisgaard M., Foster G., Kiessling N., Fahlén A.R., Olsen J.E., Christensen H. Comparative study of PCR methods to detect Pasteurella multocida. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., 2013, 126(9-10): 415-22.
  • Petersen A., Bisgaard M., Townsend K., Christensen H. MLST typing of Pasteurella multocida associated with hemorrhagic septicemia and development of a real-time PCR specific for hemorrhagic septicemia associated isolates. Vet. Microbiol., 2014, 170(3-4): 335-341 ( ) DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.02.022
  • Townsend K.M., Boyce J.D., Chung J.Y., Frost A.J., Adler B. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol., 2001, 39(3): 924-929 ( ) DOI: 10.1128/JCM.39.3.924-929.2001
  • Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Терентьева Т.Е. Типирование культур бактерии Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи ПЦР. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2013, 2: 88-93 Режим доступа: http://elibrary.ru/item.asp?id=19080328. Без даты.
Еще
Статья научная