Выравнивание почвенных условий для развития растений при деструкции растительных остатков микробными препаратами

Развитие современного сельского хозяйства направлено на получение стабильно высоких урожаев и производство семян высокого качества. В связи с этим разрабатываются прецизионные агротехнологии, выравнивающие почвенные условия (1-5).

^∗ Исследования выполняли с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» (ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург—Пушкин). Работа поддержана Российским научным фондом, грант ¹ 14-26-00094.

Вегетация растений, начиная с прорастания семян, зависит от локального состояния почвы в небольшой зоне, окружающей семена и корневую систему. Каждое растение характеризуется индивидуальными показателями высоты стеблей, числа вегетативных органов, массы надземной и корневой частей и т.д. В результате в популяциях наблюдается дисперсия (варьирование) количественных фенотипических признаков. Сверху она ограничивается допустимой нормой реакции растений на изменение экологических факторов (6) и может снижаться при выравнивании почвенных условий (7-10). Снижение вариабельности фенотипических признаков растений было обнаружено в 3-летних опытах с люцерной посевной ( Medicago sativa ) (11). Каждый год соотношение генотипической и фенотипической составляющих дисперсии массы растений изменялось. Наблюдаемое возрастание сорто-штаммовой (генотипической) составляющей и уменьшение случайной (фенотипической), возможно, было вызвано выравниванием почвенных условий в результате повышения эффективности микробно-растительного симбиоза, но также могло быть следствием адресной стимуляции микробными метаболитами (12, 13) тех растений в популяции, которые оказались в менее благоприятных условиях по сравнению с остальными.

Мы предполагаем, что эффект микробиологического выравнивания почвенных условий (МВПУ) связан с деструкцией растительных остатков микробными биопрепаратами. В этом случае происходит выборочное накопление микроорганизмами питательных ресурсов в почвенных микронишах, где изначально их было недостаточно. Возможно, МВПУ — следствие диффузии низкомолекулярных питательных веществ, возникающей при деструкции растительных остатков в зоны с пониженным содержанием питательных ресурсов. Очевидно, что на таких выравненных почвах растения должны показывать пониженную вариабельность количественных фенотипических признаков и высокое качество урожая (14).

Влияют ли на процессы МВПУ микробиологические препараты, вызывающие деструкцию растительных остатков в почве в предвегетацион-ный период года (без растений), до настоящего времени не исследовалось. Мы впервые описали эти эффекты, получив практически значимые результаты благодаря использованию оригинального фрактального анализа молекулярно-генетических частотных данных для почвенных микробных сообществ и коэффициента варьирования индивидуальных высот растений, выращенных на соответствующих почвах.

Цель настоящей работы — экспериментальное и теоретическое изучение эффекта микробиологического выравнивания почвенных условий при применении микробиологических биопрепаратов, инициирующих функционирование микробных сетей в почвах.

Методика. В I опыте (проведен в 2011-2014 годах) использовали экспериментальный образец микробиологического биопрепарата баркон для гумификации растительных остатков (разработан во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии — ВНИИСХМ), который состоял из консорциума бактерий и грибов (15). В сосуды с дерново-подзолистой почвой (по 3,5 кг, Сгум. 2,0 %, Nобщ. 0,19 %, рНсол. 5,6) вносили солому ячменя (СЯ) на глубину 0-3 см. Этот опыт включал следующие варианты: 1-й — контроль (без внесения СЯ), 2-й — внесение СЯ без инокуляции барконом, 3-й — внесение СЯ, инокулированной барконом (1 мл/10 г соломы). Измельченную СЯ (воздушно-сухая масса — 10 г/сосуд) во 2-м и 3-м вариантах вносили в сосуды 3 раза — осенью 2011, 2012 и 2013 годов. В каждом варианте было по 4 сосуда. Минеральные удобрения в течение опыта в сосуды не вносили. Растения ячменя (Hordeum L.) высаживали в сосуды весной 2012, 2013 и 2014 годов (по 30 шт/сосуд) и по окончании вегетации (осенью 2012, 2013 и 2014 годов) измеряли высоту надземной части растений (100-120 шт/вариант опыта). Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа (16) и вычисляли коэффициент варьирования этого фенотипического признака для каждого варианта опыта.

Во II (модельном) опыте молекулярно-генетические данные по микробным сообществам использовали для изучения сетевой организации микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов для деструкции соло- мы злаковых (17). В сосуды на 1 кг окультуренной дерново-подзолистой почвы (Сгум. 4,02 %; Nобщ. 0,316 %; pHсол. 5,63) вносили по 3 г измельченной соломы ржи (СР) тремя способами — поверхностно либо заделывая в слое 0-3 см и 9-12 см. Для ускорения разложения солому обрабатывали препаратами багс, баркон и омуг согласно рекомендациям разработчиков (ВНИИСХМ). Багс представляет собой консорциум целлюлозолитических микроорганизмов на основе биологически активного грунта (18); омуг — микробное удобрение, полученное после биотехнологической переработки птичьего помета (19).

На 60-е сут проводили молекулярно-генетический анализ 12 почвенных образцов с использованием стандартной методики (19) и системы генетического анализа CEQ 8000 («Beckman Coulter International S.A.», Швейцария). Данные по частоте встречаемости оперативных таксономических единиц (ОТЕ) в почвенных образцах были подвергнуты модифицированному фрактальному анализу (21-26) для получения информации о характеристиках образующихся микробных сетевых структур. Таксономические данные в исследовании не использовались. Информация о таксо- номическом анализе этих же данных представлена ранее (17).

Результаты. В I опыте (1-й и 2-й варианты) коэффициент вариации высот растений (ВВР) ячменя возрастал от первого года наблюдения к третьему (табл. 1). Вероятно, общее количество питательных ресурсов в почве снижалось, вследствие чего повышалась вариабельность почвенных условий и индивидуальных высот растений.

1. Коэффициенты вариации высот растений (ВВР) ячменя при выращивании на почве с внесением растительных остатков в виде соломы ячменя (СЯ) и в зависимости от инокуляции биопрепаратом баркон

Вариант      1	Год	Коэффициент ВВР, %
Контроль (без внесения	2012	19,8
СЯ)	2013	25,5
	2014	27,0
Внесение СЯ без инокуля-	2012	13,2
ции барконом	2013	14,9
	2014	16,3
Внесение СЯ с инокуля-	2012	17,1
цией барконом	2013	14,5
	2014	16,0
Доверительный интервал		±0,2

В 3-м варианте коэффициент ВВР с годами, напротив, уменьшался (см. табл. 1). То есть применение биопрепарата постепенно повышало эффективность функционирования почвенного микробного деструктивного сообщества. Накопление питательных ресурсов для растений и выравнивание почвенных условий может длиться несколько лет (27).

Вполне вероятно, что при этом образуются низкомо- лекулярные питательные вещества, диффундирующие в микрониши с их пониженной концентрацией, что также могло приводить к нивелированию исходных различий между микронишами.

Микробиологическая деструкция растительных остатков может быть представлена как поэтапное деление органических молекул на все большее число уменьшающихся по размерам фрагментов. В качестве математического объекта, отображающего деструкцию молекул, предлагается исполь- зовать степенные ряды дробных чисел, относящиеся к фрактальным числовым рядам (28, 29). Например, ряд чисел (1, 1/2, 1/4, 1/8, ...) — это фрактальное множество, так как он образован по фиксированному для всех чисел множества правилу: каждое следующее число ряда в 2 раза меньше предыдущего.

Числа из фрактальных рядов условно можно сопоставить с размерами фрагментов молекул. Тогда позиция во фрактальном ряду будет означать номер этапа деструкции, а текущее число ряда — размеры фрагментов молекул, которые подвергаются деструкции на соответствующем этапе. Реальные процессы деструкции происходят со сменой правил фрагментации молекул. На одних этапах число фрагментов может удваиваться, на других — утраиваться, то есть мы предполагаем, что процессы микробиологической деструкции мультифрактальны (30-34).

Наши исследования показали, что для математического моделирования фрактальными рядами сложных деструктивных процессов органических молекул достаточно использовать только три первых члена фрактальных рядов. Это ограничение значительно упрощает идентификацию сложных деструктивных процессов с заранее неизвестными правилами фрагментации и числом этапов деструкции.

Мы считаем, что деструкция органических молекул растительных остатков микроорганизмами осуществляется при образовании мультифрак-тальных сетевых структур микроорганизмов (35, 36). При этом оказывается задействовано необходимое количество микроорганизмов, пропорциональное числу фрагментов, подвергающихся деструкции. Такое допущение позволяет проводить фрактальный анализ микробиологических деструктивных процессов по частотам встречаемости ОТЕ с использованием следующего математического правила, которое связывает частоты трех ОТЕ:

HeiL-HepI

ln{p max)  ^(^max)

где p_k — частота встречаемости микроорганизмов k -й ОТЕ, осуществляющих деструкцию органических молекул на k -м этапе ( k = 0, 1, 2); p _max — частота встречаемости микроорганизмов доминирующей ОТЕ в почвенном сообществе; a — постоянный коэффициент, фрактальный индекс первичного деструктивного комплекса микроорганизмов (ПДК).

Логарифмическая зависимость [1] дает возможность выделить и идентифицировать три ОТЕ, объединенных в ПДК, в котором микроорганизмы осуществляют деструкцию органических молекул по единому правилу фрагментации. Для обнаружения нескольких ПДК в микробных сообществах требуется перебрать все возможные комбинации по три ОТЕ и выбрать те из них, которые удовлетворяют следующим равенствам:

ln ( P1) _ ln ( P 0 )

ln ( p max ) ln ( P max ) ln ⁽ P 2 ) _ ^{ln (} P 1 )

+ a

_ ln ( p max )   ln ( P _max )

+ a ( ± d )

где 1 >  p ₀ >  p ₁ >  p ₂ — частоты ОТЕ, образующих ПДК, микроорганизмы которых осуществляют деструкцию органических молекул в три этапа по единому правилу фрагментации; 0 <  d <  0,01 — допустимые пределы погрешности фрактального индекса ПДК для его идентификации, зависящие от точности измерения частотных параметров ОТЕ.

На рисунке (А) представлен упорядоченный ряд нормированных логарифмов частот встречаемости 22 ОТЕ из II опыта (вариант с применени-

Упорядоченный ряд частот встречаемости отдельных таксономических единиц (ОТЕ) , выделенных молекулярно-генетическими методами (А) , а также фрактально-таксономический портрет бактериального почвенного сообщества при поверхностном расположении на почве соломы ржи, инокулированной биопрепаратом бар-кон (Б) : 1-22 — порядковые номера ОТЕ, d — погрешность фрактального индекса ПДК (первичный деструктивный комплекс) [2]; ln ( p _max) , ln ( p_i ) — натуральные логарифмы частот встречаемости ОТЕ соответственно с максимальной частотой встречаемости и порядковым номером i в ряду частот. ОТЕ ¹¹ 2, 13, 22 удовлетворяют равенствам [2].

ем баркона и расположением инокулированной СР на поверхности почвы). Для примера показаны три ОТЕ, частоты встречаемости которых удовлетворяют равенствам [2]. Следовательно, соответствующие микроорганизмы участвовали в деструкции растительных остатков по единому правилу фрагментации и образовывали ПДК.

Для визуализации всех ПДК в сообществе микроорганизмов была предложена следующая методика построения фрактально таксономического портрета микробных сообществ (см. рис., Б) (37). На портрете каждые три кружка, соединенные вертикальными линиями, представляют три ОТЕ в составе одного ПДК. Так отображается трехэтапная деструкция органических молекул соответствующими микроорганизмами по одному из правил фрагментации. Чем больше расстояние между кружками в ПДК, тем выше коэффициент деления на фрагменты на соответствующих этапах микробиологической деструкции и фрактальный индекс ПДК. Го- ризонтальные линии, соединяющие одни и те же ОТЕ, указывают на микроорганизмы, присутствующие одновременно в нескольких ПДК. При этом проекция каждого ПДК на горизонтальную ось d указывает на погрешность фрактального индекса соответствующего ПДК [2].

В нашем опыте фрактально-таксономический портрет деструктивного микробного сообщества (см. рис., Б) представлял собой сложное сетевое образование, состоявшее из 21 ПДК, образованных 22 ОТЕ. ОТЕ ¹ 7 и ¹ 22 вошли в ПДК по одному разу, остальные — по два раза и более. Следовательно, некоторые группы микроорганизмов могли функционировать одновременно в нескольких ПДК с разными правилами фрагментации молекул. Эти микроорганизмы, возможно, одновременно синтезировали несколько ферментов, что могло приводить к уменьшению скорости синтеза и снижению эффективности функционирования всего деструктивного процесса. Поэтому индекс эффективности функционирования микробных сетевых образований (ЭСО) мы предлагаем вычислять по следующей формуле:

I NET = ln ( ^NM ) ^: ln ( 3 ' N F ) ,

где I_NET — индекс ЭСО; N_M — общее число ОТЕ, образовавших ПДК; N_F — число ПДК в микробном сообществе.

Наибольшее значение индекса ЭСО равно единице, в микробном сообществе все ОТЕ присутствуют только в одном ПДК. То есть такое микробное деструктивное сообщество функционирует с максимальной специфичностью (одна группа микроорганизмов — одна деструктивная функция).

В таблице 2 приведены индексы ЭСО, характеризующие эффективность деструкции растительных остатков почвенными микробными сообществами, которые были инициированы микроорганизмами, входящими в состав препаратов багс, баркон и омуг. В контроле индекс ЭСО оказался меньше, чем в остальных вариантах, то есть микробиологические процессы были неорганизованы и малоэффективны. Использование биопрепаратов заметно повышало эффективность функционирования микробных сообществ, что подтверждалось возрастанием индекса ЭСО по отношению к контролю и вариантам опыта без их применения.

2. Индекс эффективной сетевой организации (ЭСО) деструктивных микробных сообществ в почве при внесении соломы ржи (СР) на разную глубину и в зависимости от инокуляции различными биопрепаратами

Вариант	Глубина закладки СР в почву, см	п I NET (индекс ЭСО) [3]
Контроль (без внесения СР)		0,634
Внесение СР без инокуляции био-	0	0,662
препаратами	0-3	0,676
	9-12	0,700
Внесение СР, инокулированной	0	0,746
барконом	0-3	0,701
	9-12	0,669
Внесение СР, инокулированной	0	0,686
багсом	0-3	0,689
	9-12	0,669
Внесение СР, инокулированной	0	0,630
омугом	0-3	0,705
	9-12	0,753
Доверительный интервал		±0,003

При закладке соломы в верхние слои почвы, наибольшие значения индекса ЭСО наблюдались при применении биопрепаратов баркон и багс. Возможно, образование сетевых структур, инициированных этими биопрепаратами, происходило с привлечением аэробных почвенных микроорганизмов как поставщиков энергетических ресурсов (38). Так, в состав омуга входили микроорганизмы из кишечника птицы, то есть из анаэробной среды. При использовании омуга наибольшее значение индекса ЭСО наблюдалось при глубокой (на 9-12 см) закладке соломы в почву.

Сопоставляя данные I и II опытов, можно утверждать следующее. Основная причина отрицательной динамики коэффициента ВВР по годам в 3-м варианте I опыта заключалась в постепенном возрастании эффективности функционирования сетевых деструктивных микробных образований, инициированных биопрепаратом. Возможно, длительная настройка микробного сообщества на оптимальную деструктивную деятельность была направлена не только на деструкцию растительных остатков, но и на восстановление необходимого количества энергетических ресурсов и питательных веществ в почве, а также их выравнивание в почвенном пространстве.

Таким образом, деструкция растительных остатков с помощью специальных микробиологических биопрепаратов позволяет эффективно и с меньшими затратами решать задачи выравнивания количества энергетических ресурсов и питательных веществ в почве. Кроме того, инициация деструктивных микробиологических процессов способствует восстановлению необходимого уровня энергетических ресурсов и содержания питатель- ных веществ в почве, повышению стабильности урожаев и улучшению качества получаемой растительной продукции.