Высокомолекулярные органические соединения в почвах

Интерес к высокомолекулярным гумусовым веществам непрерывно растет, причем у специалистов не только в области почвоведения и агрономии, но и некоторых отраслей знаний, довольно далеко отстоящих от проблем почвоведения. В частности, исследования гумусовых кислот оказываются необходимыми при решении многих проблем палеогеографии и палеоклиматологии, инженерной геологии, океанологии, медицины, физиологии и геохимии, а также некоторых технических вопросов [1].

Фундаментальные работы отечественных ученых И.В. Тюрина, М.М. Кононовой, Л.В. Александровой, В.В. Пономаревой, Д.С. Орлова и многих исследователей зарубежных стран, в их числе В. Фляйг (ФРГ), Ф. Дюшофур (Франция), Т. Хаяси (Япония), М. Шнитцер (Канада), Ф. Стевенсон (США), Б. Хейес (Англия) и другие создали учение о природе и свойствах органического вещества почв. Органические соединения определяют практически все важные свойства почв. Истории изучения гумусовых кислот современными физико-химическими методами посвящен ряд обзорных работ [2, 3, 4-6, 7, 8].

В составе почвенного гумуса центральное место занимают специфические высокомолекулярные соединения: гуминовые кислоты и фульвокис-лоты (ФК). Особая роль гуминовых кислот в почвообразовании определяется их термодинамической и биохимической устойчивостью. Существуя в почвах тысячи лет (по радиоуглеродному методу до 25–35 тыс. лет) [9, 10], ГК придают им стабильность, своеобразную буферность, определенный биохимический фон. И хотя неспецифические компоненты органического вещества часто более активны и лабильны, могут определять конкретную биохимическую ситуацию в каждый конкретный отрезок времени. Именно с гумусовыми кислотами связаны важнейшие типовые признаки почв [11]. В вопросе о механизме образования и принципах строения гумусовых веществ многие положения остаются дискуссионными, хотя достигнуты существенные успехи, которые в значительной мере достигнуты в результате тесной кооперации исследований в области биохимии процесса образования ГВ с изучением их природы и строения [12, 13].

Исследования последних лет привнесли в химию гумуса много новых положений, имеющих принципиальное значение для понимания и развития теории почвообразования, диагностики и классификации почв, а также для решения прикладных задач. Преобладающая часть публикаций посвящена формированию, свойствам ГК и ФК, как наиболее характерных и важных продуктов гумификации. В современный период развития почвоведения одной из актуальных проблем в фундаментальном познании органического вещества является изучение структурно-функциональных параметров гумусовых соединений, перехода от традиционного анализа его «фракционно-группового» состава на «молекулярнофрагментарный» уровень исследований и создание теоретических основ науки о сложных по составу, структуре природных высокомолекулярных соединениях. Создание таких основ предопределено наличием колоссального эмпирического материала и огромными успехами современных методов спектроскопического анализа высокого разрешения.

Более того, современный этап развития теоретического почвоведения характеризуется усилением интереса к фундаментальной концепции – изучению элементарных почвообразовательных процессов (ЭПП) как основы современных представлений о сущности иерархии механизмов почвообразования. Эта концепция позволяет расшифровать статику почвенного профиля и дать процессную интерпретацию свойствам почв. В настоящее время в вопросах химии почв актуальной проблемой является выяснение ЭПП и их реального вклада в совокупность других профилеобразующих процессов. Одни из важнейших профилеобразующих компонентов в почвах – высокомолекулярные органические соединения: гуминовые и фульвокис-лоты. ГК являются аккумулятивным компонентом гумуса, а количество фульвокислот связывается с ними согласно термодинамической обстановке, в которой происходит формирование системы гумусовых веществ. Поэтому ГК и их соотношение с ФК выступают маркерами процессов педогенеза. Трансформация органического вещества (педоморфизм органической массы по Герасимову) логично рассматривается как гумификация – гумусообразова-ние, т.е. разложение с образованием промежуточных (предгумусовых) веществ и собственно гумуса. В почвах эти группы веществ присутствуют в разных соотношениях, причем органическая часть почвы постоянно возобновляется и преобразуется, чутко реагируя на изменение природно-зональных условий. Зональные биоклиматические условия почвообразования приводят к существенным изменениям состава и свойств высокомолекулярных гумусовых веществ. Однако гетерогенность этих классов соединений в условиях почвенной среды, а также широко используемые классические методы анализа не позволяют с достаточной степенью уверенности судить об этих изменениях.

Несмотря на обилие работ в области изучения гумуса зональных почв [1, 12 – 20] структурнофункциональные параметры высокомолекулярных соединений органического вещества почв таежной зоны европейского Северо-Востока России являются наименее изученными. Исследования, результаты которых представлены в данной работе, направлены на изучение структурной характеристики почвенного органического вещества, реакционной способности гумусовых кислот.

Объекты и методы

Объектами исследований послужили подзолистые (глееподзолистые, типичные подзолистые, дерново-подзолистые) и болотно-подзолистые (тор- фянисто-подзолисто-глееватые) почвы, сформированные на покровных суглинках. Препараты ГК и ФК были выделены по методике М.М. Кононовой и Н.П. Бельчиковой [21]. Выделение кислот проводили из воздушно-сухих образцов почв путем двукратной экстракции смесью 0.1 н NaОН и 0.1 М Na4P2O7. Далее к щелочному экстракту добавляли насыщенный раствор Na2SO4 (20% от объема экстракта) для коагуляции коллоидных частиц. Центрифугировали в течение 2 час. при 5000 об./мин. Затем серной кислотой осаждали ГК, а ФК очищали на активированном угле (марка АГ-3) по Форситу [22] и обессоливали пропусканием через катионит КУ-2 в Н+-форме. Элементный состав гумусовых кислот определяли на СHNS-O-элементном анализаторе ЕА 1110 (Италия), зольность препаратов – прокаливанием при 600°С. 13С-ЯМР спектры препаратов гумусовых веществ регистрировали на импульсном ЯМР спектрометре Bruker CXP-100 с рабочей частотой 25.18 МГц в твердофазной CPMAS – технике с вращением образца под «магическим» углом. Для регистрации ЭПР спектров исследованных препаратов гумусовых веществ применялся спектрометр SE/X2547 Radiopan при СВЧ мощности в резонаторе 20–40 мВт и частоте СВЧ 9.372 ГГц. В качестве эталона использовали дифенилпикрил-гидразил с известным содержанием радикалов. Концентрацию парамагнитных центров в образцах определяли методом сравнения относительных интенсивностей сигналов образца и эталона по значениям формулы (∆Н)2 ·Y, где ∆Н – ширина, а Y – амплитуда линии. Абсолютная ошибка определения концентрации свободных радикалов методом ЭПР составляет 10–20%.

Результаты и их обсуждение

Проведенные систематические исследования физико-химических, структурных и функциональных показателей ГВ, выполненные в рамках единого методологического подхода, позволили выявить закономерности состава и свойств органического вещества почв, сформированных на покровных суглинках таежной зоны европейского Северо-Востока России. Гумусовые кислоты представляют собой полисопряженные системы с широким спектром функциональных групп и молекулярных фрагментов. На основании исследований молекулярного строения гумусовых веществ почв методом 13С-ЯМР спектроскопии [23,24] идентифицированы следующие функциональные группы и молекулярные фрагменты: карбоксильные (–СООR); карбонильные (–С=О); CН3–, СН2–, СН– алифатические; – С-ОR спиртов, эфиров и углеводов; фенольные (Аr-OH); хинонные (Ar=O); ароматические (Ar–), что свидетельствует о большой сложности строения гумусовых веществ и полифункциональных свойствах, обусловливающих их активное участие в почвенных процессах.

Наличие карбоксильных, гидроксильных, карбонильных групп в сочетании с ароматическими структурами обеспечивает способность гумусовых кислот вступать в обменные и донорно-акцептор- ные взаимодействия, образовывать водородные связи, активно участвовать в сорбционных процессах. Формирование структурно-функциональных параметров гумусовых веществ в автоморфных типичных подзолистых почвах происходит в своеобразных условиях почвообразования. Это приводит к образованию из мохово-лесной подстилки низкомолекулярных легкоподвижных гумусовых веществ, обогащенных кислородсодержащими функциональными группами (гидроксильные, карбонильные и карбоксильные). Они способствуют мобилизации минеральных соединений в подзолистом горизонте и их вымыванию с образованием под маломощной грубогумусной подстилкой элювиального подзолистого горизонта.

В подтипе торфянисто-подзолисто-глееватой почвы избыточное увлажнение и анаэробные условия, длительные восстановительные процессы и кратковременный окислительный режим усиливают образование из мохово-травяной подстилки гумусовых веществ, имеющих более низкую степень ароматичности и содержащих в своей структуре, в основном, неокисленные алифатические фрагменты. Однако значительно большее количество свободных и связанных с полуторными оксидами фракций ГК и ФК (по сравнению с типичными подзолистыми почвами) в сочетании с промывным водным режимом и глеевыми процессами в кислой среде приводит к более интенсивному процессу подзолообразования.

Оценка относительного содержания атомов углерода основных функциональных групп и молекулярных фрагментов в препаратах ГК и ФК подзолистых и болотно-подзолистых почв проведена нами интегрированием линий поглощения в соответствующих диапазонах химических сдвигов (табл. 1).

Химические сдвиги атомов С13 молекулярных фрагментов гумусовых кислот

Химический сдвиг, ppm	Тип молекулярных фрагментов
0-47	C, H-замещенные алифатические фрагменты
47-60	метоксильные, O, N-замещенные алифатические фрагменты
60-105	алифатические фрагменты, дважды замещенные гетероатомами (в том числе углеводные)
105-144	C, H-замещенные ароматические фрагменты
144-164	O, N-замещенные ароматические фрагменты
164-183	карбоксильные группы и их производные
183-190	хинонные группы
190-204	группы альдегидов и кетонов

Для стандартизации количественных характеристик макромолекул ГВ в качестве интегрального показателя использовали отношение углерода ароматических структур к углероду алифатических цепей и процентный показатель ароматичности [7]. Сигналы от ароматических структур в этом случае суммировали по областям 105–164 и 183–190 ppm, алифатических – 0–105 и 164–183 ppm (табл. 2).

Анализ молекулярной структуры гумусовых веществ показал, что макромолекулы ГК исследованных почв содержат в своем составе значительное количество каркасных ароматических фрагментов (до 44.6 %) с относительно небольшой долей углеводной периферии, о чем свидетельствуют более высокие значения отношений Ar/AL по сравнению с ФК. Высокая ароматичность ГК обусловливает их повышенную устойчивость. В углеродном скелете фульвокислот преобладают алифатические цепочки и структуры типа углеводов, аминокислот (до 77.8 %), что определяет их высокую растворимость и низкую гидрофобность. Сравнительный анализ структурного состава гуминовых кислот подзолистых и болотноподзолистых почв показал, что исследованные препараты ГК сезонно промерзающих почв европейского Северо-Востока более обогащены ароматическими структурами по сравнению с мерзлотными подзолами (Spodic Cryosols) и менее – с ГК почв южных регионов (серыми лесными, черноземами).

Полученные аналитические материалы позволили выявить влияние гидроморфизма на молекулярную структуру гумусовых соединений исследуемых почв. Избыточное увлажнение заметно влияет не только на количество накапливаемых гумусовых соединений, но и оказывает воздействие на их молекулярную структуру, а именно, обусловливает накопление в гидроморфной торфянисто-подзолис-то-глееватой почве гумусовых веществ, обогащенных алифатическими структурами. На наш взгляд, такая взаимосвязь обусловлена тем, что при восстановлении соединений железа, марганца, азота и серы преимущественно окисляются ^{Таблица 1} спиртовые (–С-ОН) и альдегидные (–С=О) фрагменты гумусовых веществ.

При сравнении молекулярной структуры ГК подзолистых и дерново-подзолистых почв следует отметить, что ГК, выделенные из дерново-подзолистой почвы, несколько обогащены ароматическими фрагментами (табл. 2). Кроме того, происходит увеличение относительного содержания кислородсодержащих функциональных групп (–СООR) в структуре ГК дерново-подзолистой почвы. Данный факт объясняется тем, что в дерново-подзолистой почве складываются более благоприятные условия, способствующие процессу гумификации растительных остатков. Изменение молекулярного состава фульвокислот при переходе от подзолистых почв к дерново-подзолистым еще более наглядно. Содержание кислородсодержащих групп выше в препаратах ФК, выделенных из подзолистых почв. Это обусловливает их большую кислотность, растворимость в воде и способность к обменным реакциям и, как следствие – высокую агрес-

Содержание (%) молекулярных фрагментов гуминовых кислот почв (по данным 13С-ЯМР)

Таблица 2

Горизонт (глубина, см)	Химический сдвиг, ppm								Ar AL	Аро-матич-ность, %
	0 47	47 60	60 105	105144	144164	164183	183190	190204
			Типичная подзолистая
А 0 (0-5)	22.4	8.1	12.8	33.5	10.0	11.3	0.5	1.4	0.79	44.0
	23.3	6.6	23.2	18.6	7.4	19.6	0.6	0.7	0.36	26.6
А 1 А 2 h (5-7)	40.7	8.6	8.9	18.8	7.1	12.1	1.7	2.1	0.38	27.6
	25.1	6.4	18.6	10.3	4.2	25.0	3.2	7.2	0.22	17.7
		Торфянисто-подзолисто-глееватая
О 1 (0-8)	23.2	6.0	11.8	22.4	8.8	17.0	4.3	6.5	0.55	35.5
	19.5	2.4	20.2	12.9	4.2	26.3	5.1	9.4	0.29	22.2
А 2 hg	50.5	2.8	7.3	16.9	4.7	12.8	2.7	2.3	0.32	24.3
(12-20)	31.2	2.7	17.9	8.7	3.3	27.1	2.5	6.6	0.17	14.5
			Дерново-подзолистая
А дер (0-4)	33.6	23.7	3.7	16.0	6.3	12.8	1.5	2.4	0.31	24.1
	25.8	51.9	2.4	7.2	2.6	7.7	0.9	1.5	0.12	10.8

Примечание: над чертой – данные для препаратов гуминовых кислот, под чертой – для фульвокислот; все расчеты приведены на обеззоленные препараты.

зывает на возрастание во всех исследованных почвах доли ароматических фрагментов в структуре ГК при переходе от органо- генных горизонтов к минеральным.

Расчет степени окислен-ности показал, что ГК подзолистых и торфянисто-подзолисто-глееватых почв слабо восстановлены (W от –0.91 до –0.09). ФК этих почв представляют собой слабо окисленные соединения со степенью окисленности от +0.40 до +0.76. Установлено, что с нарастанием степени гумификации гумусовых кислот в минеральных горизонтах повышается степень их окисленности. Отмечена пониженная степень окисленности ФК подзолистых почв и повышенная торфянисто-подзолисто-глееватых, а для ГК характерна противоположная закономерность. Подобная особенность трансформации молекул ГК определяется интенсивностью микробиологической деятельности почв. При повышенной био сивность по отношению к почвенным минералам, что способствует интенсивному процессу оподзоливания элювиального горизонта.

В процессе освоения типичных подзолистых почв в пахотном горизонте происходят значительные изменения: снижается кислотность, повышается степень насыщенности почвенно-поглощающего комплекса основаниями. Это приводит к увеличению количества гуминовых кислот и изменению содержания функциональных групп в их составе, выражающемуся в относительном уменьшении карбоксильных функциональных групп и повышении доли ароматических молекулярных фрагментов с развитой системой конденсированных ароматических ядер, логической активности происходит быстрое разрушение неспецифических соединений и простых гумусовых веществ. Поэтому высокая биологическая активность подзолистых почв по сравнению с торфя-нисто-подзолисто-глееватыми способствует окислению молекул ГК, что приводит образованию и накоплению устойчивых кислородсодержащих продуктов. ФК в подобных условиях являются одними из предельновысоких доступных соединений для почвенных микро-организмов и поэтому быстро ими разрушаются. Это приводит к постоянному их обновлению. В результате ФК типичных подзолистых почв представлены молодыми и менее окисленными фрагментами.

На основании проведенных исследований что делает гумусовые кислоты и способствует их накоплению в пахотном горизонте.

Результаты, полученные методом 13С-ЯМР спектроскопии, согласуются с данными элементного состава гумусовых кислот. Анализ элементного состава препаратов гумусовых кислот показал, что ГК и ФК типичной подзолистой почвы более гумифицированы по сравнению с гумусовыми кислотами тор-фянисто-подзолисто-глееватой почвы. Это обусловливает низкие значения атомных отно-

менее агрессивными

б4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

получен массив данных по элементному составу

Гидрогенизация

Восстановление

Окисление

Дегидрогенизация

шений (Н/С)исп и высокие О/С в препаратах ГК и ФК типичной подзолистой почвы. Уменьшение отношения (Н/С)исп ука-

0,25               0,50               0,75               1,00               1,25

□ а О б ]                        О/С

Рис. 1. Атомные соотношения элементов в препаратах гуминовых (а) и фульвокислот (б).

препаратов гумусовых кислот почв разного генезиса. Графико-статистический анализ гумусовых веществ типичных подзолистых, торфянисто-подзо-листо-глееватых и пахотных подзолистых почв по Д. ван Кревелену подтверждает более высокую окисленность и низкую обуглероженность ФК по сравнению с ГК. Это указывает на значительную за-мещенность ароматических колец и развитие боковых алифатических цепей (рис. 1). Результаты элементного анализа гумусовых кислот пахотной подзолистой почвы также подтверждают, что сельскохозяйственное освоение приводит к увеличению доли ароматических фрагментов, выражающемуся в уменьшении отношения (Н/С)исп по сравнению с целинными аналогами.

Исследования молекулярно-массового распределения препаратов гумусовых веществ, выделенных из подзолистых, глееподзолистых и торфя-нисто-подзолисто-глееватых почв, свидетельствуют, что ГК содержат три фракции с разной молекулярной массой: >150 kDa, 73-80 kDa и 13-23 kDa; ФК – две фракции: >5 kDa, 1-2 kDa (табл. 3, 4). Невысокая молекулярная масса ФК способствует их лучшей растворимости и миграционной способности.

Таблица 3

Средние молекулярные массы фульвокислот и их содержание (G-25, элюент – дистиллированная вода)

Горизонт (глубина, см)	Фракция I	Фракция II
	М, kDa      Массовая ,           доля, %	М, kDa      Массовая ,           доля, %

Типичная подзолистая

А 0 (0-5)	> 5	23.2	1.2	76.8
А 2 (7-10)	> 5	30.4 Глееподзолистая	1.6	69.6
А 0 (0-5)	> 5	36.0	2.2	64.0
А 2 g (5-10)	> 5	28.0	1.6	72.0 Таблица 4

Средние молекулярные массы фракций гуминовых кислот и их относительное содержание (G-100, элюент – Tris–HCl–буфер, рН = 8.2)

Горизонт (глубина, см)	Фракция I		Фракция II		Фракция III
	М, kDa	Массовая доля, %	М, kDa	Массовая доля, %	М, kDa	Массовая доля, %
А 0 (0-5)	>150	Типичная подзолистая 21.29     80.2     15.81			16.7	62.90
А 2 (7-10)	>150	13.02	80.2	17.36	16.4	69.62
A 2 hg (12-20)	Торфянисто-подзолисто-глееватая >150     9.83      73.2     26.8      13.4					63.37
А пах (0-30)	>150	Пахотная подзолистая 39.97     78.7     13.46			22.8	46.57

Гуминовые кислоты автоморфных почв характеризуются высоким содержанием низкомолекулярных фракций, а доля высокомолекулярной фракции в ГК подстилки в 1.5–2 раза выше, чем в ГК подзолистого горизонта. Оценено влияние сельскохозяйственного использования почв на фракционный состав гумусовых соединений. Отмечено резкое увеличение доли высокомолекулярной фракции в препаратах ГК пахотной подзолистой почвы – в 2–4 раза по сравнению с ГК целинных подзолистых почв. Это может быть обусловлено как природой поступающих растительных остатков, так и повышенной микробиологической активностью освоенных почв.

Исследована парамагнитная активность гумусовых кислот, которая характеризует зрелость и сформированность гумусовых веществ, их устойчивость к деструкции и минерализации под воздействием биотических и абиотических факторов. Свободные радикалы гуминовых кислот, обладая большим запасом энергии и высокой активностью, играют важную роль в химических реакциях между органическими, органоминеральными и минеральными веществами. В ГК исследованных почв со- держание свободных радикалов в 1.5–5 раз больше, чем в препаратах фульвокислот, что обусловливает их высокую способность к реакциям полимеризации и комплексообразования по радикальному механизму (рис. 2, 3). Содержание свободных радикалов в препаратах гуминовых кислот уменьшается по профилю исследованных почв. Это свидетельствует о более высокой устойчивости их молекул в минеральных горизонтах по сравнению с гуминовыми кислотами органогенных горизонтов.

По содержанию парамагнитных центров в препаратах ГК и ФК выявлена близость подзолистых поверхностно-глееватых почв к типичным подзолистым. Усиление степени гидроморфизма приводит к повышению концентрации свободных радикалов в структуре гумусовых кислот.

Сельскохозяйственное использование почв снижает парамагнитную активность их гумусовых соединений по сравнению с целинными аналогами более, чем на 20 % и приводит к накоплению в пахотном горизонте более гумифицированных и биотермодинамически устойчивых соединений [25].

Заключение

Методами 13С-ЯМР и ЭПР спектроскопии изучен качественный и количественный составы гу-

Рис. 2. Содержание свободных радикалов в препаратах гуминовых кислот почв разной степени гидроморфизма: 1 – подзолистая, 2 – подзолистая поверхностно-глееватая и 3 – торфянисто-подзолисто-глееватая (n = 5, P = 0.95).

Рис. 3. Содержание свободных радикалов в препаратах фульвокис-лот почв разной степени гидроморфизма: 1 – подзолистая, 2 – подзолистая поверхностно-глееватая и 3 – торфянисто-подзолисто-глее-ватая (n = 5, P = 0.95).

чающиеся по растворимости ФК и ГК выполняют противоположные геохимические функции. Фульво-кислоты повышают миграционную способность элементов в почве, а гуминовые – представляют собой мощный геохимический барьер. Гидрофобность ароматических структур ядра гумусовых веществ позволит оценить экологическую устойчивость гумуса. Исследования динамичной периферийной части гумусовых кислот являются основой для диагностики процессов почвообразования и степени деградации почвенного органического вещества при антропогенных нагрузках. Дальнейшие исследования-структурно-функциональных параметров гумусовых веществ позволят расшифровать внутримолекулярный «порядок», который ранее считался «хаосом», и перейти на количественный уровень описания взаимосвязи структура – молекулярная масса. Разработка указанных теоретических параметров является основой при параметрической оценке экологического потенциала почв, разработке теории устойчивости почв – важной составной части теории устойчивости наземных экосистем и биосферы в целом, реконструкции природной среды, а также создания веществ (препаратов) с контролируемым составом и воспроизводимыми показателями, что открывает пути для практического применения ГВ: в области охраны окружающей среды – детоксикации поллютантов, в сельском хозяйстве – расширение номенклатуры стиму- мусовых веществ почв таежной зоны, определены основные функциональные группы и молекулярные фрагменты. Основу молекулы ГК образует ядро, сформированное ароматическими и гетероциклическими кольцами. Ядро окружено периферическими однозамещенными и двузамещенными алифатическими цепочками, более гидрофильными по сравнению с ядром. Конституционная часть молекулы ГК – функциональные группы, главным образом карбоксильные и фенолгидроксильные, определяющие кислотный характер ГК и способность к катионному обмену и комплексообразованию. Ароматическое ядро – комплексная стабилизирующая структура, обеспечивающая устойчивость почвенного гумуса. ГК по сравнению ФК содержат меньше кислородсодержащих функциональных групп и больше ароматических соединений, т.е. гидрофильно-липофильный баланс ГК смещен в гидрофобную сторону, а ФК – в гидрофильную. Разли- ляторов роста и развития растений.

Работа выполнена при финансовой поддержке ОБН РАН и гранта РФФИ (№ 07-04-00285).