Взаимодействие растений с наночастицами благородных металлов

В последние десятилетия не только учеными, но и мировым сообществом уделяется большое внимание нанотехнологиям, основанным на использовании объектов размером не более 100 нм при синтезе, сборке и модификации веществ, материалов и конструкций с необычными (зачастую неожиданными) свойствами. Со специфическими характеристиками (физико-химическими, структурными, оптическими и т.п.) и адекватными методами получения, изучения и использования таких материалов и композиций связано обособление явлений и понятий в этой области размеров (1). Особый интерес представляют токсикологические эффекты и воздействие наночастиц металлов и их оксидов на биологические системы (2), потому что физико-химические характеристики наночастиц значительно отличаются от таковых для частиц больших размеров и массивных материалов (3).

Золотые и серебряные наночастицы находят применение в разнообразной биомедицинской практике в качестве носителей лекарственных

Работа частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты ¹¹ 14-0400114, 16-04-00520).

веществ, усилителей и (или) преобразователей оптического сигнала, иммуномаркеров и др. (4, 5). Из-за развития промышленных нанотехнологий случайное воздействие искусственно созданных наночастиц на клетки растений и животных становится все более вероятным, что требует анализа его последствий. По примерной оценке ежегодное производство серебряных наночастиц (Ag НЧ) в США составляет 3-20 т (6), в Европе — 5,5 т (7), а глобальное использование в мире — около 800 т (8). Попадая с неизбежностью в окружающую среду, наночастицы могут вызывать трудно предсказуемые (в том числе нежелательные) экологические эффекты (9). Золотые наночастицы (Au НЧ) наиболее активно применяются в медикобиологических целях (5), чем вызвана необходимость исследовать фармакокинетику, биораспределение по органам и тканям и возможную токсичность этих соединений (10, 11). Но если способам проникновения в клетку, последующей трансформации и элиминации из клетки и организма в целом, токсичности наночастиц для микроорганизмов и животных посвящено довольно большое число работ (10-15), то взаимодействие наночастиц с клетками растений во многом остается terra incognita.

О положительном или отрицательном влиянии наночастиц на клетки растений и растительный организм известно очень немного, и эти данные весьма противоречивы (16-20), хотя существует множество наноразмер-ных частиц, с которыми растения могут вступать в контакт в естественных условиях. Кроме того, техногенные наночастицы по физическим и химическим свойствам часто близки к наночастицам природного происхождения. Например, недавно выяснилось, что под влиянием климатических факторов в геологических отложениях, обогащенных золотом, формируются наноструктуры — наносферы и нанопластинки, сходные по размерам и форме с производимыми в лаборатории (21). Также сообщается о разработке подходов к использованию растений в качестве инструмента для биотехнологического синтеза наночастиц («зеленая химия») (22). Высказывается предположение, что образование наночастиц может служить растениям способом детоксикации при загрязнении почвы металлическими поллютантами (23).

В настоящем обзоре мы обобщили появившиеся в последние годы сведения о взаимодействии высших растений с наиболее широко распространенными наночастицами благородных металлов — золота и серебра.

Проникновение наночастиц в клетки и ткани растений. Недавно опубликовано несколько обзоров, посвященных взаимодействию металлических наночастиц с высшими растениями (24-27) и водорослями (28, 29). Оказалось, что водоросли, особенно одноклеточные, в частности Dunaliella salina Teod., представляются удобным модельным объектом для изучения воздействия Au НЧ и Ag НЧ на живые клетки (30, 31).

Одной из первых статей, посвященных проникновению наночастиц в ткани и клетки растений, грибов и водорослей, была работа E. Navarro с соавт. (32). Известно, что клеточная стенка (структура, специфичная для растений, грибов и водорослей) лимитирует поступление крупных молекул и частиц, позволяя проходить малым. Она служит первичным звеном во взаимодействии клетки с наночастицами и барьером для их проникновения. Диаметр пор (в среднем 5-20 нм) ограничивает размер наночастиц, способных преодолеть клеточную стенку. Однако имеются данные о том, что наночастицы могут сами модулировать размер пор клеточной стенки и, снимая таким образом жесткие структурные ограничения, доходить до плазма-леммы (32). Предполагается, что на следующем этапе наночастицы способны попадать внутрь клетки посредством эндоцитоза, однако у растений этот процесс изучен недостаточно. Имеются данные, что Au НЧ проникают в 14

ткани Oryza sativa L. и Solanum lycopersicum L. за счет как клатрин-зависи-мого, так и клатрин-независимого эндоцитоза (33).

Для изучения эндоцитоза в прорастающих пыльцевых трубках табака Nicotiana tabacum L. были использованы отрицательно и положительно заряженные Au НЧ (34). Электронная микроскопия убедительно показала, что Au НЧ благодаря эндоцитозу быстро захватываются и оказываются в мембранных везикулах. Апикальный рост пыльцевых трубок — достаточно быстрый процесс, при котором постоянно обновляется кортикальный актиновый цитоскелет и плазмалемма. Возможно, в подобных системах (и в протопластах) наночастицы могут доставляться в клетку при эндоцитозе (35). Предположительно так же попадают в ткани растений другие типы наночастиц: золотые нанозвезды (36), парамагнитные наночастицы (37), наночастицы оксида кремния (38) и оксида магния (39), углеродные нанотрубки (40).

В ряде исследований показано (41-44), что Au НЧ никогда не обнаруживались в надземных частях растений редиса, тыквы, ячменя, тополя, пшеницы в отличие, например, от табака, томата, люцерны, райграсса, кукурузы, бамбука и риса. Кроме вида растений, эффективность проникновения Au НЧ в ткани зависит от размера и поверхностного заряда наночастиц. Положительно заряженные Au НЧ активно поглощаются только корнями растений, в то время как отрицательно заряженные Au НЧ также способны активно перемещаться от корней в стебли и листья (33, 45). Обсуждается участие в этом процессе как плазмодесм, так и сосудистой системы растений (41, 46). Мелкие наночастицы проникают в надземные части растений эффективнее, чем крупные, кроме того, они более токсичны. Для Ag НЧ этот факт, возможно, объясняется большей склонностью к диссоциации мелких частиц и токсичным действием ионов металла (13, 47).

Интересные данные получены методами масс-спектрометрии и рентгеновской флуоресценции при изучении поступления Au НЧ размером 5, 10 и 15 нм в ткани N. tabacum (48): Au НЧ обнаружили не только в листьях растений, но и в тканях табачного бражника ( Manduca sexta ), который ими питался. На примере искусственной водной экосистемы показано (49), что золотые наностержни активнее проникают в ткани моллюсков, креветок и рыб, нежели в ткани водных растений Spartina alterniflora Loisel. В то же время у Ag НЧ токсичность для клеток водорослей и ракообразных проявлялась при значительно меньших концентрациях, чем для клеток млекопитающих ( ∼ 0,1 мг Ag/л против ∼ 26 мг Ag/л) (13).

Биологические эффекты при воздействии наночастиц металлов на растения. Токсичности наночастиц различной природы по отношению к растениям посвящены несколько обстоятельных обзоров (50-56), однако данные о механизмах фитотоксичности, приведенные в этих публикациях, весьма немногочисленны и противоречивы.

S. Arora с соавт. (57), изучая влияние наночастиц на рост и урожайность горчицы Brassica juncea L. в полевом эксперименте, опрыскивали растения суспензиями Au НЧ с разной плотностью. Наличие Au НЧ в тканях определяли с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии. Авторы отмечали положительный эффект применения Au НЧ: длина и диаметр стебля, а также число листьев и побегов увеличивались, урожайность повышалась. Сходные результаты получены при проращивании семян горчицы на базальной питательной среде (58) и при использовании Ag НЧ (59). C помощью синхротронного рентгеновского микроанализа и трансмиссионной электронной микроскопии высокого разрешения показано, что Au НЧ диаметром 3,5 нм проникают в растения Nicotiana xanthi через корни и перемещаются по сосудистой системе. Агрегаты Au НЧ размером 18 нм обна- руживались только в цитоплазме клеток корня (60). При воздействии мелких Au НЧ через 14 сут наблюдались некротические повреждения листьев, но в присутствии крупных Au НЧ не отмечали отличий от контроля. Отсутствие эффекта или незначительный физиологический эффект при очень высоких концентрациях Au НЧ описаны для Glycine max L. (61) и водных аквариумных растений (62, 63).

Ag НЧ на ранних стадиях онтогенеза Brassica napus L. существенно стимулировали нарастание массы корней и стеблей, при этом несколько снижалась энергия прорастания и всхожесть семян (64). В то же время обработка семян Boswellia ovalifoliolata N.P. Balakr & A.N. Henry препаратом Ag НЧ заметно ускоряла прорастание и рост саженцев (65). Схожий эффект наблюдался при воздействии Ag НЧ на семена Asparagus officinalis L. (66). Кроме того, авторы отмечают повышение содержания аскорбиновой кислоты и хлорофилла в проростках, обработанных Ag НЧ. Описано снижение всхожести, замедление образования клубеньков (за счет уменьшения численности бактерий-симбионтов Rhizobium leguminosarum ), роста побегов и уменьшение длины корней у Vicia faba L. при добавлении в питательную среду Ag НЧ (67). В присутствии Ag НЧ в гидропонной среде для выращивания Solanum lycopersicum (68) и Raphanus sativus L. всхожесть не снижалась, но при этом уменьшалась длина корней и побегов и несколько снижалась активность фотосинтеза (69). По мнению C.L. Doolette с соавт. (70), потенциальный риск отрицательного воздействия Ag НЧ на растения Lactuca sativa L. очень низкий: содержание Ag в съедобных частях растения составило < 1 % от общего количества, добавленного в почву. Сходные данные получены для Ag НЧ, Au НЧ и наночастиц оксида железа при воздействии на Lactuca sativa и Cucumis sativus L. (71): авторы отмечали низкую или нулевую токсичность для всех типов наночастиц. Отрицательный эффект дисперсионной среды иногда был значительнее оказываемого наночастицами, что, возможно, обусловлено диффузией ионов металлов в среду. Так, за 3 мес хранения содержание Ag в наночастицах снижалось на 7 % (72).

Влияние наночастиц на развитие растений может быть дозозависимым. Обнаружено (73), что при проращивании семян Oryza sativa на среде с Ag НЧ (30 мг/мл) рост корней усиливался, однако при повышении концентрации наночастиц до 60 мг/мл рост проростков замедлялся по сравнению с контролем. Кроме того, уменьшалась численность ризосферных микроорганизмов вследствие повреждения бактериальной клеточной стенки под воздействием Ag НЧ. Ингибирование роста в зависимости от дозы Ag НЧ и времени воздействия продемонстрировано для Lemma minor L. (74): при больших концентрациях наблюдались признаки окислительного стресса и изменения в структуре хлоропластов. У Phaseolus radiates L. и Sorghum bicolor L. ингибирование роста из-за добавления Ag НЧ сильнее проявлялось при выращивании на питательной среде, но не в почве (75). Размеры частиц тоже влияют на токсические эффекты. Так, по отношению к Spirodela polyrhiza L. мелкие (6 нм) Ag НЧ оказались токсичнее, чем крупные (20-1000 нм) (76). Также показано, что коллоидное серебро по сравнению с массивным металлом в большей степени ингибировало прирост биомассы у Cucurbita pepo L. (77).

Часть работ по изучению механизмов проникновения наночастиц в растительные ткани и фитотоксичности выполнена на классическом объекте физиологии растений — Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (78-81).

Имеются данные о влиянии Au НЧ на прорастание семян A. thaliana (82). Добавление Au НЧ диаметром 24 нм (10-80 мг/л) в среду культивирования приводило к повышению общей всхожести семян арабидопсиса в 3 раза 16

по сравнению с контролем, а также к заметному увеличению длины и диаметра стебля и корней. Интересные результаты представили A.F. Taylor с соавт. (83). По их данным, у A. thaliana длина корня при выращивании на агаризованной среде с Au НЧ (100 мг/л) редуцировалась на 75 %. Это сопровождалось повышением экспрессии генов, которые кодируют белки, участвующие в реакциях растения на стресс, — глутатионтрансферазу, глю-козилтрансферазу, пероксидазу и цитохром Р450. В то же время незначительно понижалась экспрессия генов, которые кодируют аквапорины и белки, вовлеченные в транспорт ионов меди, кадмия, железа, никеля.

Гораздо более выраженным генотоксическим эффектом обладал хлорид золота (84). В целом токсичность ионов металлов заметно превосходит токсичность наночастиц (85), а фитотоксический эффект у Ag НЧ выше, чем у Au НЧ (86). Токсический эффект проявлялся в ингибировании удлинения корней арабидопсиса, увеличении на 2-3 сут времени вегетации, снижении скорости прорастания семян у потомства и, по мнению авторов, был обусловлен диффузией ионов серебра с поверхности Ag НЧ.

В то же время в другой работе (87) на арабидопсисе показано, что сублетальные концентрации Ag НЧ (до 1 мг/л) обладали выраженным фитостимулирующим эффектом. Он проявился в увеличении длины корней, сырой биомассы и усилении эвапотранспирации у проростков. При этом нитрат серебра оказывал токсичное действие уже при концентрации 0,05 мг/л.

Сообщалось о влиянии формы и размера Ag НЧ на экспрессию генов фитогормонов и развитие проростков у арабидопсиса (88), причем проявление эффекта определялось концентрацией Ag НЧ. Эти наночастицы индуцировали экспрессию гена ауксин-зависимого фактора транскрипции и одного из ключевых ферментов синтеза абсцизовой кислоты. Кроме того, Ag НЧ снижали ингибирование роста корней у проростков Arabidopsis , вызванное воздействием АЦК (аминоциклопропан-1-карбоновая кислота, предшественник синтеза этилена), а также уменьшали экспрессию гена синтеза АЦК ( ACS7 ) и его конверсии в этилен ( ACO2 ). Был сделан вывод, что Ag НЧ действуют на этапе рецепции этилена и отрицательно влияют на его биосинтез (88). Известно, что ионы серебра эффективно ингибируют биосинтез этилена — фитогормона, регулирующего процессы при стрессе, старении (созревание) и др., тогда как ионы золота не влияют на биосинтез и сигналинг этилена (89, 90). Показано, что плазматическая мембрана A. thaliana чувствительна к Ag НЧ, и при их содержании в среде культивирования 300 мг/л у растений подавляется удлинение корней и рост листьев, снижается эффективность фотосинтеза (91). Высказывается мнение (92), что при этом фитотоксичность обусловлена накоплением в тканях активных форм кислорода (главным образом, под воздействием ионов серебра, диффундирующих с поверхности Ag НЧ).

Исследование проникновения наночастиц в клетки и цитотоксичности зачастую проводят на суспензионных культурах клеток животных и человека (10-12, 93). С учетом того, что механизмы защиты от неблагоприятных факторов имеют много общего для всех живых организмов, использование суспензионных культур клеток растений, по нашему мнению, может оказаться достаточно эффективным при изучении влияния наночастиц металлов на растительные клетки. Отличительная черта суспензионных культур растительных клеток — их более высокая чувствительность к широкому спектру соединений и абиотических воздействий по сравнению с целым растением (94, 95). Эти свойства определяются особенностями физиологического состояния клеток, в том числе способностью воспроиз- водить разнообразные ответные реакции на уровне метаболической и генетической регуляции. Развитие ответных биохимических и физиологических реакций в культуре клеток происходит за короткий период времени и достаточно равномерно во всей популяции (в отличие от целого растения или его органов). Кроме того, можно ожидать большей выраженности воздействия наночастиц на клетки суспензионной культуры ввиду отсутствия специализированных защитных структур — кутикулы, эпидермиса и др.

Показано, что добавление в среду культивирования Au НЧ и Ag НЧ диаметром 20 нм положительно влияет на прирост биомассы в суспензионной культуре клеток A. thaliana . Установлено, что характер изменения рН среды при культивировании клеток с Au НЧ и Ag НЧ неодинаков: Ag НЧ вызывали выраженное закисление, Au НЧ — защелачивание культуральной среды. В присутствии наночастиц металлов незначительно, но устойчиво снижалась удельная дыхательная активность клеток суспензионной культуры A. thaliana , происходило увеличение внутриклеточного пула свободных аминокислот (аланина, γ -аминомасляной кислоты, валина), характерное для ответных реакций на абиогенные стрессы (96). Кроме того, добавление наночастиц приводило к изменению спектра экстраклеточных белков и структуры актинового цитоскелета в культуре клеток A. thaliana (97).

Противоречивые (зачастую противоположные) данные о влиянии наночастиц золота и серебра на растения (табл.) объясняются, на наш взгляд, различиями в условиях экспериментов (неодинаковые размеры и заряды наночастиц, вводимые дозы, длительность наблюдения и др.).

Влияние наночастиц благородных металлов на растения

Диаметр, нм Условия эксперимента Растение Эффект Ссылка доза 1 субстрат время 10 10 мг/л Г Наночастицы 2 нед   Ячмень Аu Отсутствие влияния на прорастание (43) 5, 10, 15 30, 100 мг/л Г 3-7 сут Табак семян; снижение биомассы и длины корней Усиление роста (48) 3,5 48 мг/л Г 2 нед Табак Некротические повреждения листьев (60) 18 10-20 76 мг/л 0-100 мг/кг ПО 50-70 сут Горчица Отсутствие эффекта Увеличение высоты и диаметра стеб- (57) 50 0-400 мг/л ПС 10 сут Горчица ля, числа листьев и побегов, урожайности Увеличение длины корней (58) 5, 10, 20 0-17 мкM П 2 нед Соя Отсутствие эффекта (61) 24 10-80 мг/л ПС 15 сут Арабидопсис Повышение общей всхожести семян (82) 7, 18, 49, 108 0-400 мг/л ПС 2 нед Арабидопсис Редуцирование длины корня (83) 20 50 мг/л ПС 72 ч Арабидопсис Прирост биомассы суспензионной (97) 30 0-400 мг/л ПС Нан 1 нед очастицы Горчица культуры клеток Аg Увеличение длины корней, усиление (59) 10 0,75-18 мкМ ПС 1 нед Рапс фотосинтеза Увеличение массы корней и стеблей; (64) 30-40 10-30 мг/л ПС 3 нед Босвеллия снижение энергии прорастания и всхожести семян Ускорение прорастания семян и (65) 20 100 мг/л ПС 25 сут Спаржа роста саженцев Повышение содержания аскорбино- (66) 5-50 800 мг/кг Почва 5 нед Бобы вой кислоты и хлорофилла Снижение всхожести, замедление (67) 10-15 0-1000 мг/л Г 6 сут Томаты образования клубеньков, подавление роста побегов и длины корней Значительное подавление роста (68) 2 0-500 мг/л ПС 5 сут Редька корней, снижение фотосинтеза Отсутствие влияния на прорастание; (69) 20 30, 60 мг/л ПС 1-3 нед Рис уменьшение длины корней и побегов Увеличение/уменьшение роста кор- (73) 10, 100 5 мг/л ПС 2 нед Ряска ней в зависимости от концентрации Ингибирование роста в зависимости (74) от дозы и времени воздействия; окислительный стресс, изменение структуры хлоропласта

			Продолжение таблицы
5-25	0-40 мг/л	П, ПС	5 сут	Сорго, бобы	Ингибирование роста	(75)
6, 20, 1000	0,5-10 мг/л	ПС	72 ч	Многокорен-ник	Ингибирование роста в зависимости от размера частиц	(76)
100	0-500 мг/л	Г	1 нед	Тыква	Уменьшение биомассы	(77)
20-80	67-535 мг/л	Г	2 нед	Арабидопсис	Ингибирование удлинения корней, увеличение на 2-3 сут времени вегетации, снижение скорости прорастания семян у потомства	(86)
5, 10, 25	0,01-100 мг/лГ		6 нед	Арабидопсис	Увеличение длины корней, сырой биомассы и эвапотранспирации	(87)
8, 45	0-100 мкМ	ПС	3 сут	Арабидопсис	Увеличение длины корней; активация экспрессии генов, участвующих в пролиферации клеток, обмене веществ, и генов гормонального сигналинга	(88)
40	300-5000 мг/л ПС		4-10 сут	Арабидопсис	Ингибирование удлинения корней и роста листьев, снижение эффективности фотосинтеза	(91)
100	50-100 мкМ	ПС	10 сут	Арабидопсис	Окислительный стресс	(92)
20	30 мг/л	ПС	72 ч	Арабидопсис	Прирост биомассы суспензионной культуры клеток	(97)
Примеч	а н и е. Г — гидропоника,		ПС — питательная среда, П — почва, ПО — полевой опыт.

Подводя итог, отметим, что активные исследования токсичности наночастиц по отношению к растениям ведутся фактически не более 10 лет. Этот срок, по-видимому, еще мал для того, чтобы все аспекты проблемы были выяснены так, как того требуют принципы биобезопасности. Тем не менее, накопленный материал достаточен для ряда предварительных принципиальных заключений. Полученные данные свидетельствуют как о положительном, так и об отрицательном воздействии наночастиц металлов на растения (98). Факторы, которые, несомненно, обусловливают процессы внутриклеточного проникновения наночастиц, — их химическая природа, размер, форма, поверхностный заряд, доза. Имеющийся арсенал методов определения металлов в органах, локализации и идентификации наночастиц на клеточном и субклеточном уровнях, а также оценки цитотоксичности in vitro адекватен поставленным задачам и надежно апробирован. Перспективным объектом для изучения влияния металлических наночастиц на растения могут служить суспензионные культуры клеток.

Таким образом, проблема взаимодействия наночастиц металлов с растениями, несмотря на актуальность, далека от убедительного решения. Нужна скоординированная программа исследований, которая выявила бы корреляции между параметрами частиц (размер, форма, поверхностная функционализация), дизайном эксперимента (модель, доза, способ и временн а я схема введения, длительность наблюдений, исследуемые органы, клетки, субклеточные структуры и т.п.) и наблюдаемыми биологическими эффектами (в том числе при изучении трофических цепей). Кроме того, требуются согласованные усилия по введению стандартов на частицы и методы, используемые для тестирования токсичности наноматериалов.