Взаимодействие везикул штаммов Vibrio cholerae O1 El Tor с клетками-мишенями

EDN: KQHNLZ

В 90-х гг. прошлого столетия в результате мутаций появились и получили широкое распространение природные геноварианты V. cholerae El Tor. Данные штаммы содержат в опероне ctxАB , кодирующем биосинтез холерного токсина (ХТ), ген ctxB классических вибрионов ( ctxB1 ), в отличие от типичных El Tor вибрионов, имеющих аллель ctxB El Tor ( ctxB3 ). Были также обнаружены и другие геноварианты возбудителя, несущие новую аллель гена ctxAB7 , который, в отличие от аллеля ctxAB1 , имеет дополнительную замену С/А в позиции 58. Геноварианты синтезируют повышенное количество ХТ I (классического) типа, приближаясь по данному показателю к высокотоксигенным штаммам классического биовара [Заднова и др., 2019].

Как и другие грамотрицательные бактерии, холерные вибрионы образуют везикулы наружной мембраны (ВНМ), которые признаны общим механизмом бесконтактного транспорта и коммуникации [Guerrero-Mandujano et al., 2017]. С помощью ВНМ большинство грамотрицательных бактерий экспортируют комплексы белков, липидов и связанных с наружной мембраной [Аронова и др., 2021]. Образование везикул наружной мембраны штаммами V. cholerae сlasssical и El Tor, их композиционный состав и протективные свойства описаны как отечественными, так и зарубежными исследователями [Zingl et al., 2021; Омельченко и др., 2023; Дуванова и др., 2024] . Образование ВНМ из клеток V. cholerae наблюдается во время роста бактерий в жидких и агаровых средах, в составе биопленки, а также во время инфекции внутри организма хозяина. Ранее нами было показано, что типичные штаммы и геноварианты V. cholerae El Tor в жидкой среде AKI образуют ВНМ, содержащие холерный токсин, локализованный внутри везикул, а также определено его биологическое действие на культуру клеток CHO-К1 и HuTu 80 [Алексеева и др., 2024; Якушева и др., 2024].

Поскольку ВНМ содержат биологически активные молекулы, они выполняют множество биологических функций, включая доставку токсинов и протеаз во время инфекции [Rompikuntal et al., 2015; Rasti, Brown, 2019], влияют на структуру биопленок [Potapova, 2024], защищают от антимикробных препаратов и бактериофагов [Reyes-Robles et al., 2018], усиливают адгезию бактерий к эукариотическим клеткам [Божокина, Берсон, 2021]. Зарубежными исследователями показано, что ВНМ V. cholerae сlasssical и El Tor проникают в эпителиальные клетки кишечника и высвобождают факторы вирулентности, такие как холерный токсин, протеазы и др. [Chatterjee, Chaudhuri, 2011; Rompikuntal et al., 2015; Zingl et al., 2021].

Поглощение везикул клетками-мишенями происходит либо путем фагоцитоза, либо путем классического эндоцитоза, после чего факторы вирулентности дифференцированно разделяются во время внутриклеточного транспорта везикул и могут проявлять свою токсическую активность [Bielaszewska et al., 2017]. Для изучения этих процессов применяются различные способы обнаружения поглощения везикул клетками-хозяевами, одним из которых является обработка антителами. Такое окрашивание можно обнаружить с помощью проточной цитометрии или микроскопии. Еще один метод, используемый в практике для изучения поглощения везикул клетками-хозяевами, основан на окрашивании везикул флуоресцирующими красителями, такими как липофильный краситель Dio, ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат) [O’Donoghue, Krachler, 2016]. Эти красители позволяют неспецифически метить липиды или белки ВНМ, применяются для изучения кинетики поглощения на живых клетках и используются для обнаружения везикул снаружи и внутри клеток-хозяев. Данный метод относят к неспецифическим, поэтому его необходимо использовать в сочетании с мечеными антителами [Macion et al., 2021]. Несмотря на достигнутые успехи в области изучения взаимодействия ВНМ с клетками-мишенями, остается много вопросов, требующих продолжения исследований. Так, конкретные механизмы связывания везикул геновариантов с клетками-хозяевами и проникновение в них, до сих пор полностью не исследованы.

Цель работы – получение ВНМ V. cholerae El Tor, изучение их поглощения клетками-мишенями и влияния на адгезивные свойства.

Материалы и методы исследования

Все этапы работы были выполнены в соответствии с СанПин 3.3686-21 «Санитарноэпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». В работе использовали ток-сигенные штаммы V. cholerae О1 El Tor Ogawa : ( ctx B3 , tcpA^ET , rtxA 1) – № 1310; ( ctx B1 , tcpA^ET , rtxA 1) – № 18367; ( ctxB7, tcpA^CIRS, rtxA4 ) – № 19188/2; ( ctxB7, tcpA^CIRS, rtxA4а ) – № 19667, полученные из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Штаммы V. cholerae О1 El Tor с различными генотипами были подобраны согласно их паспортным данным. Все исследуемые штаммы были типичными по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам. Бактерии культивировали на агаре Мартена, pH 7.7.

Для сравнительного анализа проникновения в клетки-мишени были использовано два типа токсинсо-держащих везикул, полученных ранее при культивировании типичного штамма V. cholerae О1 El Tor 1310 и геновариантов 18367, 19188/2, 19667, выращенных в бульоне AKI до логарифмической фазы роста [Якушева и др., 2024] и после выращивания в течение 18 ч на агаре Мартена с добавлением 0.1% желчи [Avila-Calderón et al., 2018]. Бактерии смывали с помощью стеклянного шпателя 0.1 М фосфатно-солевым буфером pH 7.2 до образования однородной суспензии, далее полученную бактериальную массу разводили в объеме 250 мл. Обеззараженные мертиолятом натрия (1:10000) микробные клетки удаляли центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин. Супернатант пропускали через фильтры типа GVWP с диаметром 0.45 мкм и 0.22 мкм, чтобы исключить клеточный детрит, и добавляли ингибитор протеаз, не содержащий ЭДТА (Sigma-Aldrich/Roche) для предотвращения деградации белка. Из бесклеточного супернатанта концентрирование везикул осуществляли центрифугированием при 100 000 g в течение 2 ч при 4° C. Осадок дважды промывали 25 мл стерильного 0.1 M фосфатно-солевого буфера pH 7.2 и центрифугировали при той же скорости в течение 1 ч, затем ресуспендировали в 1 мл 0.1 M фосфатно-солевого буфера, pH 7.2. Разливали на аликвоты и хранили при –20°С.

Концентрацию белка измеряли методом Лоури [Lowry, 1951]. Концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для БСА. Липополисахариды (ЛПС) в везикулах измеряли в имму-ноферментном анализе с помощью комплементарных ему специфических моноклональных антител ги-бридомы (ГХ-F8/О1), депонированной ранее в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386Д. Концентрацию ЛПС рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для ЛПС, выделенного по общепринятой методике O. Westphal [Westphal, 1965] из штамма V. cholerae О1 El Tor № 5879 (ЛПС О1).

Визуализацию, размеры и форму везикул в полученных препаратах оценивали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Образцы наносили на поверхность формаровой пленки-подложки и контрастировали 0.2% раствором уранилацетата в воде.

Поглощение везикул оценивали на перевиваемых клеточных линиях Caсo-2 (человек, аденокарцинома ободочной кишки) и HuTu 80 (человек, аденокарцинома двенадцатиперстной кишки) (РКККП, Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург). Выращивание культур клеток Caсo-2 и HuTu 80 проводили согласно паспортным данным. Вне периода постановки опытов коллекционные культуры хранились в криоконсервированном состоянии в биохранилище с жидким азотом при –196°С. Все этапы с перевиваемыми линиями клеток были выполнены в соответствии с рекомендациями [Фрешни, 2018].

Везикулы метили флуоресцин изотиоцианатом (ФИТЦ). Для этого полученные препараты ресуспен-дировали в 0.1 М бикарбонате натрия (pH 9.0) и добавляли ФИТЦ в соотношении 1:1. Конъюгацию проводили в течение 1 ч при температуре 25°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Свободный краситель удаляли из меченых везикул, дважды промывая фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (46 000 ×g, 1 ч).

Культуру клеток промывали 3 раза ФСБ, в бессывороточной среде вносили меченные ФИТЦ везикулы и выдерживали в течение определённого интервала времени (10, 20, 40 мин, 1, 2, 4, 6, 8 ч) при 37°С в СО 2 -инкубаторе. По истечении времени 3 раза промывали ФСБ, фиксировали холодным 96° спиртом в течение 20 мин и полностью высушивали. Для гашения неспецифического свечения культуры клеток наносили 0.025% раствор трипанового синего на 20 мин при +4°С. Отмывали 3 раза ФСБ, полностью высушивали и просматривали под флуоресцирующим микроскопом [Chatterjee, Chaudhuri, 2011].

Маркировку ФИТЦ иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомой (ГХ-A5D8/OmpU), депонированную в «ГКПМ-Оболенск» (№179) [Евдокимова и др., 2016], направленных к мембранному белку OmpU, осуществляли по методу [Антитела, 1991]. Конъюгация длилась не менее 2 ч в условиях холодильника при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Для освобождения от несвязавшегося флуорохрома меченные ФИТЦ МКА диализовали против 0.15 М NaCl.

Для установления красящего титра высушенные и фиксированные мазки бактериальных взвесей V. cholerae О1 El Tor обрабатывали раствором ФИТЦ МКА в разведении начиная 1:2 до 1:32 и помещали во влажную камеру. Через 30 мин промывали 2 раза ФСБ и 1 раз дистиллированной водой, затем подсушивали на воздухе. Учет результатов проводили по 4-крестовой системе на люминесцентном микроско- пе. Активность поглощения исследовали у всех препаратов везикул в разных концентрациях – от 500 нг/мл до 2 мкг/мл.

Эксперимент проводили в 6-луночных планшетах с покровными стеклами, на которых сформировался разреженный монослой клеток. В лунки планшета вносили препарат нативных везикул и инкубировали в течение определённого интервала времени (10, 20, 40 мин, 1, 2, 4, 6, 8 ч) при 37°С в СО 2 -инкубаторе. По истечении времени 3 раза промывали ФСБ, фиксировали холодным 96° спиртом в течение 20 мин и полностью высушивали. Далее для пермеабилизации культуру обрабатывали 1% раствором тритона Х-100 в ФСБ в течение 20 мин при комнатной температуре, промывали 3 раза ФСБ и наносили 0.025% раствор трипанового синего на 20 мин при +4°С, промывали 3 раза ФСБ и добавляли меченные ФИТЦ антитела на 40 мин при 37°С, по прошествии времени промывали 3 раза ФСБ, полностью высушивали и просматривали под флуоресцирующим микроскопом.

Для исследования роли ЛПС в поглощении везикул использовали препарат ЛПС из штамма V. cholerae О1 El Tor № 5879. ВНМ меченные ФИТЦ 500 нг (количество ЛПС в 500 нг везикул каждого исследуемого препарата представлено в табл. 1) смешивали с препаратом ЛПС, который добавляли с избытком 3 мкг. Клетки-мишени промывали 3 раза ФСБ и в бессывороточной среде вносили смесь везикул с препаратом ЛПС, в контрольную лунку с клетками-мишенями вносили в бессывороточной среде меченные ФИТЦ ВНМ в количестве 500 нг и инкубировали в течение 3 ч в СО 2 -инкубаторе при 37°С. Далее 3 раза промывали ФСБ, фиксировали холодным 96° спиртом в течение 20 мин и полностью высушивали. Неспецифическое свечение культуры клеток гасили с помощью 0.025% раствора трипанового синего в течение 20 мин при +4°С. Отмывали 3 раза ФСБ, полностью высушивали и просматривали под флуоресцирующим микроскопом.

Таблица 1

Количество ЛПС в препаратах везикул, полученных из бульонных и агаровых культур

V. cholerae О1 El Tor

[LPS content in vesicle preparations obtained from broth and agar cultures of V. cholerae O1 El Tor]

Препараты везикул, полученные	Концентрация ЛПС (мкг) в 500 нг препарата
	1310	18367	19188/2	19667
при культивировании штаммов V. cholerae О1 El Tor в бульоне AKI	0.3	0.13	0.06	0.07
после выращивания культур на агаре Мартена с добавлением 0.1% желчи	0.3	0.16	0.13	0.15

Роль ЛПС в интернализации ВНМ оценивали по конкурентному ингибированию. При участии ЛПС избыток этого препарата конкурирует за сайты связывания и блокирует поглощение везикул – в результате клетки-мишени визуализируются без флуоресцентного свечения. В контрольной лунке флуоресценция сохраняется. Если ЛПС не участвует в поглощении, флуоресцентное свечение наблюдается в обеих лунках.

Количественную оценку адгезии штаммов V. cholerae после обработки клеток мембранными везикулами проводили по методу [Патент ..., 2016] одновременно на двух клеточных линиях – HuTu 80 (человек, аденокарцинома двенадцатиперстной кишки) и Caco-2 (человек, аденокарцинома ободочной кишки). К разреженному монослою клеток HuTu 80 или Caco-2 вносили везикулы в дозе 500 нг и инкубировали в течение 1 ч. Далее среду отбирали, клетки промывали 3 раза раствором Хенкса рН 7.4. Среду заменяли на свежую DMEM, содержащую 10⁶ м. к. / мл испытуемых штаммов холерных вибрионов. Клетки HuTu 80 или Caco-2 в присутствии холерных вибрионов культивировали при 37ºС в СО 2 -инкубаторе 90 мин. После этого среду удаляли, и индекс адгезии определяли, как описано выше.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили в программе , вычисляя среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической. Оценку статистической достоверности различий средних значений проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Критерием статистической ошибки достоверности различия получаемых данных считали величину ошибки p ≤ 0.05. Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Результаты и их обсуждение

В последние годы появилось немало публикаций, касающихся интернализации ВНМ патогенных бактерий в клетки-хозяева. Поглощенные везикулы могут способствовать инфицированию хозяина, нарушать функции его клеток и модулировать иммунную защиту и реакции хозяина [Ellis, Kuehn, 2010].

Для сравнительного анализа проникновения в клетки-мишени были использованы два типа везикул. С помощью ТЭМ установлено, что везикулы V. cholerae О1 El Tor в жидкой и плотной среде имели целую, непрерывную мембрану. При визуальной оценке препаратов везикул обнаружено, что они были сферической формы, а диапазон их размеров находился в пределах от 50 до 200 нм (рис. 1). Полученные 182

данные согласуются с ранее опубликованными нами и результатами зарубежных авторов, показавших, что холерные вибрионы в естественных условиях образуют везикулы с аналогичным размером [Chatterjee, Chaudhuri, 2011; Алексеева и др., 2024; Якушева и др., 2024]. При ТЭМ препаратов везикул не были обнаружены обломки бактериальных клеток, жгутики и пили.

Рис. 1. Электронная микроскопия препарата везикул, на примере штамма V. cholerae О1 № 19667, выращенного на агаре Мартена с добавлением 0.1% желчи

[Electron microscopy of a vesicle preparation using the example of V. cholerae strain O1 № 19667 grown on Marten agar supplemented with 0.1% bile]

Для оценки клеточной интернализации выделенные препараты везикул были конъюгированы с ФИТЦ. Использование этого флуоресцирующего красителя в процессе изучения интернализации было описано в исследовании [Kesty et al., 2004]. Клетками-мишенями служили одновременно две линии: CaCo-2, традиционно применяемая для этих целей, и HuTu 80, которая на действие холерного токсина реагирует удлинением и появлением игольчатых отростков. Обе клеточные линии относятся к непрофессиональным фагоцитирующим клеткам.

Для определения оптимальной концентрации, дающей четкий флуоресцентный сигнал, использовали разные количества везикул. Для этого флуоресцентно-меченые везикулы, начиная с 100 нг/мл до 1 000 нг/мл, добавляли к монослою эпителиальных клеток Caсo-2 и HuTu 80 и через 2 ч после инкубации просматривали под микроскопом. В результате было отмечено, что для визуализации четкого флуоресцентного сигнала при поглощении эпителиальными клетками Caсo-2 и HuTu 80 флуоресцентно-меченых везикул необходимо использовать количество ВНМ, равное 500 нг/мл.

Известно, что эндоцитарные процессы в кишечном эпителии протекают быстро [Olofsson et al., 2014], поэтому процесс интернализации оценивали в динамике, начиная от 10 мин до 6 ч. Интенсивность флуоресценции в клетках Caсo-2 и HuTu 80 увеличивалась по мере поглощения везикул. После инкубации в течение 20 мин можно было регистрировать, как агрегируют и связываются с клеточной плазматической мембраной флуоресцентно-меченые везикулы. Через час начиналась интернализация. Количество поглощенных везикул в интервале от 1 до 3 ч со временем увеличивалось. Нарастание интернализации везикул со временем также было описано для Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa в ряде исследований [Kesty et al., 2004; Furuta et al., 2009; Bauman, Kuehn, 2009; Parker et al., 2010]. Через 3 часа практически все везикулы проникали в клетки-мишени.

Ранее было показано, что холерный токсин локализуется внутри везикул и является биологически активным [Алексеева и др., 2024; Якушева и др., 2024]. В экспериментах после 4 ч инкубации меченых ВНМ с клетками HuTu 80 наблюдали внутриклеточные флуоресцирующие включения и морфологическое изменение клеток, характерное для действия холерного токсина, в клетках Caсo-2 были также обнаружены флуоресцирующие включения. Известно, что клетки Caсo-2 на действие холерного токсина не отвечают морфологическими изменениями, регистрируемыми под микроскопом [Moal, Servina, 2013]. Через 6 ч инкубации флуоресценция полностью гасла.

Однако этот метод изучения поглощения флуоресцентно-меченых везикул не является строго специфичным, т. к. в процессе конъюгации везикул с флуоресцирующими красителями молекулы последних могут образовывать агрегаты и обогащенные домены, и в дальнейшем поглощается клетками-мишенями [O’Donoghue, Krachler, 2016]. Существует другой метод, используемый в практике для изучения поглощения ВНМ клетками-хозяевами, – иммуноокрашивание. Этот метод позволяет продемонстрировать, как доставляется содержимое ВНМ, и изучить вклад этого содержимого во взаимодействие с клеткой-хозяином (связывание/проникновение), а также визуализировать колокализацию с определенными клеточными компартментами. Для иммуноокрашивания везикул V. cholerae используют поликлональные антисыворотки против протеаз HAP, VesC [Mondal et al., 2016] и PrtV [Rompikuntal et al., 2015], а также белка везикул OmpU [Bielig et al., 2011].

Для доказательства того, что флуоресценция была вызвана везикулами, меченными ФИТЦ, а не свободным красителем, были проведены дополнительные исследования. Известно, что белок наружной мембраны OmpU является маркером везикул [Elluri et al., 2014; Sjöström et al., 2015]. Располагая гибри-домой (ГХ-А5D8/OmpU) были приготовлены экспериментальные образцы флуоресцирующих МКА, направленных к мембранному белку OmpU везикул. Используя мазки штаммов V. cholerae О1 El Tor, было определено рабочее разведение полученного препарата ФИТЦ-МКА OmpU, равное 1:4.

Далее для определения поглощения к клеткам мишеням были внесены разные концентрации нативных везикул от 500 нг/мл до 2 мкг/мл и окрашены ФИТЦ-МКА OmpU. Установлено, что разведение ФИТЦ-МКА OmpU, равное 1:4, давало возможность обнаружить четкий флуоресцирующий сигнал везикул в дозе 2 мкг/мл (рис. 2). Также следует отметить, что специфическое свечение наблюдалось в культуре обеих линий с концентрацией 1 мкг/мл везикул, но в поле зрения выявлялись единичные везикулы. Возможно, это связано с тем, что распределение мембранного белка OmpU по поверхности наружной мембраны составляет 30% [Заднова, 2004], а образование везикул происходит локально.

Уточним, что интактные везикулы поглощались за такой же период времени, что и флуоресцентномеченые везикулы. При визуальной оценке не было отмечено разницы в интенсивности поглощения везикул, выделенных типичным штаммом и геновариантами V. cholerae О1 El Tor, а также между везикулами, выделенными из разных сред культивирования.

1                            2                          5                          4

Рис. 2. Интернализация клетками-мишенями HuTu 80 иммуноокрашенных везикул на примере штамма № 19667. Примечание: 1 – 10 мин воздействия; 2 – 20 мин воздействия; 3 – 4 ч воздействия; 4 – 6 ч воздействия

[Internalization of immunostained vesicles from strain No. 19667 by HuTu 80 target cells.

Note: 1 – 10 minutes of exposure; 2 – 20 minutes of exposure; 3 – 4 hours of exposure; 4 – 6 hours of exposure]

Специфическое взаимодействие холерного вибриона и энтероцита хозяина осуществляется в результате тесного контакта между патогеном и клеткой-хозяином. Поверхности везикул наружной мембраны имеют сходное строение с внешней мембраной бактерий, что обеспечивает широкий спектр веществ для взаимодействия с поверхностью клетки-хозяина. Как было показано нами ранее, везикулы типичного штамма и геновариантов V. cholerae О1 El Tor образуются из наружной мембраны и содержат полноценный ЛПС [Якушева и др., 2024]. O-антиген занимает терминальное положение в структурной области ЛПС и, благодаря своему расположению, вероятно, является первым структурным элементом, вступающим в непосредственный контакт с клетками-хозяевами.

По данным литературы, у E. coli структура ЛПС, особенно область О-антигена, имеет решающее значение для проникновения ВНМ в клетки-мишени [O'Donoghue et al., 2017]. ВНМ, утратившие О-антиген, могут использовать клатрин-зависимый эндоцитоз для интернализации; в то же время везикулы с полноценным О-антигеном проникают в клетки-мишени зависимым от рафтов путем [Cai et al., 2018].

В настоящее время нет сведений о роли ЛПС в проникновении везикул природных геновариантов V. cholerae О1 El Tor в клетку-мишень. Если допустить, что O-антиген, присутствующий на поверхности везикул типичного штамма и геновариантов V. cholerae О1 El Tor, может быть основным эпитопом, обеспечивающим адгезию и последующее поглощение ВНМ клетками-мишенями, то очевидно, что в случае предварительного смешивания препарата ЛПС с препаратами везикул и внесения к клеткам-мишеням должно вызвать конкуренцию за сайты связывания и, как следствие, блокировать поглощение везикул. Экспериментальные данные свидетельствуют, что добавление ЛПС к везикулам не влияло на интернализацию последних, т. к. в клетках-мишенях регистрировали специфическое свечение (рис. 3). Следовательно, в использованных экспериментальных условиях не было выявлено участия ЛПС в интернализации везикул V. cholerae ЛПС клетками-мишенями.

Развитие любого инфекционного процесса определяется первичным взаимодействием патогена с клетками хозяина, за которым следует проявление его патогенных свойств. Поэтому большое значение придается изучению адгезивных свойств микроорганизмов, в том числе и V. cholerae . Согласно данным литературы, везикулы Serratia grimesii [Божокина, Берсон, 2021], Campylobacter jejuni [My Le et al., 2024]

усиливают способность бактериальных клеток прикрепляться к эпителиальным клеткам. Однако о влиянии везикул холерных вибрионов на прикрепление микробных клеток к клеткам-мишеням сведения отсутствуют. При изучении факторов, влияющих на бактериальную адгезию, важным этапом является определение адгезивных свойств холерных вибрионов к клеткам-мишеням без какого-либо воздействия. Исследование проводили на двух клеточных линиях HuTu 80 и Сасо-2, изучали адгезивные свойства холерных вибрионов, из которых выделены везикулы. Для этого на покровное стекло с разреженным монослоем клеток HuTu 80 или клеток Сасо-2 вносили 1 мл среды DMEM, содержащей 10⁶ м. к./мл исследуемых штаммов V. cholerae О1 El Tor и инкубировали в течение 90 мин при 37ºС в СО 2 -инкубаторе и определяли индекс адгезии (табл. 2).

Рис. 3. Интернализация клетками-мишенями Caco-2 флуоресцентно-меченых везикул на примере штамма № 19667: а – поглощение клетками Caco-2 флуоресцентно-меченых везикул; б – поглощение клетками Caco-2 флуоресцентно-меченых везикул с добавлением препарата ЛПС

[Internalization of fluorescently labeled vesicles from strain No. 19667 by Caco-2 target cells.

Note: a – internalization of fluorescently labeled vesicles by Caco-2 cells; b – internalization of fluorescently labeled vesicles by Caco-2 cells with the addition of the LPS preparation]

Таблица 2

Анализ адгезивных свойств штаммов V. cholerae O1 El Tor [Analysis of adhesive properties of V. cholerae O1 El Tor strains]

№ п/п	Препараты везикул, полученные из штаммов	Индекс адгезии к клеткам-мишеням
		до воздействия везикул		после воздействия везикул
		HuTu 80	Caco-2	HuTu 80	Caco-2
1	V. cholerae О1 El Tor № 1310	3.2±0.025	3.51±0.031	4.8±0.029	5.0±0.025
2	V. cholerae О1 El Tor № 18367	10.18±0.034	10.28±0.037	15.27±0.032	15.34±0.029
3	V. cholerae О1 El Tor № 19188/2	12.28±0.041	12.56±0.042	30.7±0.023	31.0±0.038
4	V. cholerae О1 El Tor № 19667	23.7±0.043	24.0±0.041	59.25±0.022	59.45±0.040

Примечание: приведены средние значения и стандартное отклонение, p ≤ 0.05.

Сравнение показателей индекса адгезии позволило разделить исследуемые штаммы на три группы. Типичный штамм V. cholerae О1 El Tor № 1310 имел значение индекса адгезии 3.2 к клеткам HuTu 80 и 3.51 к клеткам Caco-2 , что позволяет отнести его к низкоадгезивным штаммам. Геноварианты штаммов V. cholerae О1 El Tor № 18367 и № 19188/2 отличались от типичного штамма более высокими показателями индекса адгезии в отношении обоих типов клеток HuTu 80 (10.18; 12.28) и Caco-2 (10.28; 12.56) соответственно. Такие показатели позволяют отнести их к штаммам со средним уровнем адгезии. В то же время у штамма V. cholerae О1 El Tor № 19667 был зарегистрирован самый высокий показатель индекса адгезии для обоих типов клеток-мишеней HuTu 80 и Caco-2, который равнялся соответственно 23.7; 24.0 соответственно. На основании этого штамм относится к высокоадгезивным (рис. 4). Далее было оценено влияние везикул, полученных из клеток агаровых культур, на адгезивные свойства штаммов. Предварительно их инкубировали в течение часа с клеточными линиями HuTu 80 и Сасо-2 , а затем вносили клетки холерных вибрионов, и их совместное культивирование продолжалось 90 мин. В результате проведенных исследований установлено, что везикулы, полученные из агаровых культур, усиливали прикрепление холерных вибрионов к клеткам-мишеням в 1.5–2.5 раза в зависимости от штамма (см. табл. 1, рис. 4).

Можно предположить, что ВНМ V. cholerae способствуют усилению адгезии за счет изменения экспрессии рецепторов на поверхности клеток-мишеней.

Рис. 4. Адгезия к культуре клеток Сасо-2 и HuTu 80 (Увеличение 100х10, окраска по Романовскому-Гимзы).

Примечание: адгезия до обработки ВНМ к культуре клеток HuTu 80 штамма V. cholerae О1: 1 – № 1310;

2 – № 18367; 3 – № 19188/2; 4 – № 19667; адгезия после обработки ВНМ к культуре клеток HuTu 80 штамма V. cholerae О1; 5 – № 1310; 6 – № 18367; 7 – № 19188/2; 8 – № 19667; адгезия до обработки ВНМ к культуре клеток Сасо-2 штамма V. cholerae О1: 9 – № 1310; 10 – № 18367; 11 – № 19188/2; 12 – № 19667; адгезия после обработки ВНМ к культуре клеток Сасо-2 штамма V. cholerae О1: 13 – № 1310; 14 – № 18367; 15 – № 19188/2; 16 – № 19667 [Adhesion to Caco-2 and HuTu 80 cell culture (Magnification 100x10, Romanovsky-Giemsa stain) Note: adhesion of V cholerae O1 strains to HuTu 80 cell culture before OMV treatment: 1 – №. 1310; 2 – № 18367; 3 – № 19188/2;

4 – № 19667; adhesion of V. cholerae O1 strains to HuTu 80 cell culture after OMV treatment: 5 – № 1310; 6 – № 18367; 7 – № 19188/2; 8 – № 19667; adhesion of V. cholerae O1 strains to Caco-2 cell culture before OMV treatment: 9 – № 1310;

10 – № 18367; 11 – № 19188/2; 12 – № 19667; adhesion of V. cholerae O1 strains to Caco-2 cell culture after OMV treatment: 13 – № 1310; 14 – № 18367; 15 – № 19188/2; 16 – № 19667]

Заключение

Таким образом, в настоящей работе представлены данные относительно методических подходов конъюгации токсинсодержащих ВНМ с ФИТЦ, а также моноклональных антител к белку наружной мембраны OmpU. С помощью флуоресцентно-меченых везикул и флуоресцирующих МКА, направленных к белку наружной мембраны OmpU, установлено взаимодействие везикул наружной мембраны холерных вибрионов с клетками-мишенями HuTu 80 и Сасо-2 .

Показано, что временной интервал интернализации и накопление ВНМ, выделенных из типичного штамма и геновариантов V. cholerae O1 El Tor, в клетках-мишенях сопоставим.

Также установлено, что ЛПС не участвует в интернализации ВНМ V. cholerae О1 El Tor. Результаты работы показали, что везикулы усиливают способность бактериальных клеток прикрепляться к эпителиальным клеткам кишечника.

Пока остается открытым вопрос, каким эндоцитарным путем везикулы геновариантов холерных вибрионов проникают в клетки-мишени, исследования в этом направлении будут продолжены.