Взаимодействие желатины с хитозаном: влияние концентрации полисахарида

В последние годы в пищевой промышленности, биотехнологии и медицине наблюдается увеличение спроса на новые материалы на основе (био)полиэлектролитных комплексов (ПЭК) ( Изумрудов , 2008; Gubbala , 2012). Подобные комплексы формируются из противоположно заряженных (комплементарных) биополимеров: белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. Если соотношение между противоположно заряженными группами биополимеров в комплексе составляет 1:1, то ПЭК называют стехиометричными, в противном случае – нестехиометричными ( Зезин, Кабанов , 1982; Kramarenko et al. , 2006). Теоретические аспекты формирования, физико-химические свойства и направления практического использования полиэлектролитных комплексов, образованных как из природных, так и из синтетических полиэлектролитов достаточно подробно изложены, например в обзорах ( Зезин, Кабанов , 1982; Изумрудов и др. , 1991; Кабанов , 2005; Kramarenko et al. , 2006; Изумрудов , 2008; Gubbala , 2012).

Использование катионного полисахарида хитозана в качестве своеобразной "матрицы" для формирования (био)полиэлектролитных комплексов является перспективным с точки зрения рационального использования биоресурсов. Биологическим предшественником хитозана является целлюлозоподобный биополимер хитин. Хитин – это основа скелетной системы членистоногих и второй после целлюлозы по распространенности в природе полисахарид. Линейные цепи хитина состоят из связанных (1-4)–гликозидной связью хитобиозных единиц (остатки 2-дезокси-2-ацетамидо- β -D-глюкана) (рис. 1а). В макромолекуле хитозана, в отличие от хитина, значительная часть хитобиозных единиц деацетилирована (рис. 1б) ( Быкова, Немцев , 2002; Muzzarelli, Muzzarelli , 2009).

В кислой среде макромолекулы хитозана обладают высокой плотностью положительного заряда благодаря ионизации свободных аминогрупп. По этой причине в кислых растворах хитозана в присутствии отрицательно заряженных полиэлектролитов возникает самосборка (био)полиэлектролитных комплексов (Изумрудов, 2008; Изумрудов и др., 2011). Формирование и стабильность (био)ПЭК на основе хитозана зависит от множества факторов: степень ионизации и плотность зарядов полиэлектролитов, распределение зарядов вдоль полимерных цепей, природа и расположение ионных групп на полимерных цепях, молекулярная масса и массовое соотношение полиэлектролитов, гибкость полимерных цепей, порядок смешивания и длительность взаимодействия полиэлектролитов, температура, ионная сила и pH среды (Il'ina, Varlamov, 2005; Краюхина и др., 2008; Hamman, 2010).

(а)                                              (б)

Рис. 1. Структурная формула хитозана

Полиэлектролитные комплексы хитозана с отрицательно заряженными полиэлектролитами исследованы достаточно хорошо, например с ДНК ( Евдокимов , 2002; Patel et al. , 2010), каррагинанами ( Mitsumata et al. , 2003; Pinheiro et al. , 2012; Briones, Sato , 2013; Li et al. , 2013), натриевой солью КМЦ ( Mitsumata et al. , 2003), сульфатом ацетата целлюлозы ( Шибайло и др. , 2008), полистиролсульфонатами и полиметакрилатами ( Изумрудов и др. , 2011). В зависимости от условий (главным образом – соотношение компонентов и рН среды) хитозан с данными полиэлектролитами может образовывать как стехиометричные, так и нестехиометричные комплексы, которые являются предшественниками различных самоорганизующихся ( self-assembling ( Hamman , 2010)) структур (гелей, пленок, нанослоев, нано- и микрокапсул для доставки лекарств и т.д.).

Вместе с тем вопросы формирования (био)ПЭК хитозана с полиамфолитами изучены не так подробно. Биополимер желатина – продукт деструкции белка коллагена – имеет положительно и отрицательно заряженные группы в составе макромолекулы. В тканях хордовых коллаген несет те же структурирующие функции, что и хитин в тканях членистоногих. Подобно хитину коллаген имеет практически неисчерпаемый природный источник (до 60 % белковых веществ в тканях млекопитающих). Отрицательный заряд желатины создается остатками глутаминовой Glu и аспарагиновой Asp кислот, число которых на 1 000 аминокислотных остатков полиамфолита из разных природных источников составляет соответственно 69 ÷ 72 и 47 ÷ 48 ( Veis , 1964; Yannas , 1972; Haug, Draget , 2009).

Ранее авторы данной статьи исследовали особенности формирования (био)полиэлектролитных комплексов желатины с анионными полисахаридами из морских водорослей: альгинатом натрия ( Derkatch et al. , 2001; Воронько и др. , 2002; 2004) и κ -каррагинаном ( Деркач и др. , 2014; Маклакова и др. , 2014) вблизи изоэлектрической точки (pI) желатины. Согласно некоторым данным ( Yin et al. , 2005) устойчивые комплексы щелочной желатины с хитозаном формируются в диапазоне рН выше 4.7 (выше pI щелочной желатины) и ниже 6.7 (до начала выпадения хитозана в виде осадка из раствора).

Целью настоящей работы является исследование формирования (био)ПЭК желатины с хитозаном и коллоидно-химических свойств водных дисперсий комплексов при рН ниже pI желатины, где хитозан имеет положительный заряд, а диссоциация остатков Glu и Asp желатины в значительной степени подавлена. Интерес к данной области pH вызван тем, что хитозан растворяется исключительно в кислой среде ( Быкова, Немцев , 2002; Muzzarelli, Muzzarelli , 2009).

2.    Экспериментальная часть

В работе использовали щелочную желатину типа B из бычьей кожи с твердостью по Блуму 225 ( Gelatin Type B from bovine skin 225 Bloom ) производства Sigma-Aldrich (США). В использованном образце желатины массовая доля: белка 75 %, влаги 10.2 %, золы (в сухом остатке) 1.6 %, изоэлектрическая точка pI 4.7 (определяли вискозиметрическим и турбидиметрическим методами).

Использовали хитозан из панцирей креветки ( Chitosan from shrimp shells ) производства Sigma-Aldrich (Исландия). В образце хитозана степень деацетилирования составляла 86 %.

Средневязкостную молекулярную массу биополимеров M _η определяли по их характеристической ( intrinsic ) вязкости [η] в натрий-ацетатном буфере, используя уравнение Марка – Куна – Хаувинка:

• -    для желатины при условиях: 35 °С, pH 4.7, I = 0.1 ( Veis , 1964)

[ п ] = 1.66 - 10 - 5 M _п ^0.885,                                             (1)

• -    для хитозана при условиях: 25 °С, pH 4.5, I = 0.2 ( Лопатин , 2010)

[ п ] = 13.8 - 10 " ⁵ M _п ^0.85.                                         (2)

Эффективный радиус макромолекулярного клубка биополимеров при бесконечном разбавлении Ref ^ рассчитывали по формуле ( Тагер , 2007):

3 Ы М n

V10 П N A

R } ef,

Экспериментальные исследования показали: для желатины M _n = 96 kDa, Rf ^ = 9 нм; для хитозана M = 260 kDa, АП = 29 нм.

П                      ef. “

Золи желатины готовили по стандартной методике с предварительным набуханием в воде или 0.1 M растворе уксусной кислоты при 20 ° С и последующим растворением при 40 ° С. Золи желатины в воде имели pH от 4.8 до 4.9 ( = pI), в уксусной кислоте - pH 3.4. Хитозан растворяли в 0.1 M уксусной кислоте при 70 ^оС с предварительным набуханием в течение суток при 20 ° С. Значения pH золей хитозана лежали в диапазоне от 3.1 до 3.9, незначительно возрастая при увеличении концентрации хитозана.

Исходные золи желатины и хитозана смешивали при температуре 40 ° С в пропорциях, соответствующих установленным концентрациям биополимеров в образце. рН полученных смесей от 3.2 до 3.9 (< pI желатины). В этой области рН во всем исследованном диапазоне концентраций биополимеров фазового разделения и коацервации системы не наблюдалось.

Относительную ( related) вязкость n _rel золей измеряли методом капиллярной вискозиметрии при температуре (30.00 ± 0.01) °С, время термостатирования перед началом измерений 30 мин. Использовали капиллярный вискозиметр ВПЖ (вискозиметр Оствальда – Фенске), внутренний диаметр капилляра 0.56 мм, длина 85 мм. Максимальная скорость сдвига на стенках капилляра у r составила 14.0 с^-1, а напряжение сдвига τ r – 11.2 мПа. Критерий Рейнольдса для всех исследованных жидкостей был на несколько порядков ниже критического значения Re c = 2300, что указывает на ламинарный характер течения ( Малкин Исаев , 2010).

УФ-спектры поглощения исследованных систем в области ближнего ультрафиолета (диапазон длин волн λ от 190 до 360 нм) были получены методом абсорбционной спектроскопии ( Рабек , 1983).

Эффективный радиус R ef частиц дисперсной фазы в золях желатины, хитозана и их смесей определяли турбидиметрически методом дисперсии светорассеяния ("спектра мутности") ( Klenin , 1999) в диапазоне длин волн λ от 450 до 550 нм. Экспериментально полученные данные аппроксимированы степенными моделями Ангстрема:

A = k X n ,                                                  (4)

где A – оптическая плотность ( absorbance ); λ – длина волны, нм; k – константа, не зависящая от размера частиц дисперсной фазы и длины волны падающего света; n – волновой экспонент (функция размера частицы, не зависящая от длины волны). Коэффициент парной корреляции составил r = 0.959 + 0.998. R ef частиц определяли из рассчитанного по уравнениям Ангстрема (4) значения волнового экспонента n .

Спектрометрические и турбидиметрические измерения проводили на спектрометре T 70 UV / visibl e ( PG Instruments , Великобритания), толщина кюветы 1 см, температура измерений 23 °С. Перед началом измерений растворы выдерживали в кювете спектрометра при данной температуре в течение 2.5 ч, так как предварительно было установлено, что за это время в объеме растворов формируются частицы постоянного размера.

3.    Результаты и обсуждение

На рис. 2 представлена кривая турбидиметрического титрования золя желатины золем хитозана. Видно, что при увеличении массового соотношения биополимеров Z в системе, оптическая плотность A растет, достигая максимального значения 1.312 при Z = 0.78 г хит./г жел. До этого массового соотношения биополимеров при низком содержании хитозана и избытке желатины формируются стехиометричные (био)полиэлектролитные комплексы постоянного состава. Увеличение оптической плотности связано с увеличением концентрации комплексов в смеси. Дальнейшее увеличение Z (увеличение содержания хитозана) приводит к уменьшению оптической плотности смесей. При этом формируются нестехиометричные комплексы желатины с хитозаном переменного состава. При уменьшении содержания желатины в комплексе, положительный заряд полисахарида становится нескомпенсированным, растворимость полиэлектролитных комплексов растет и оптическая плотность уменьшается. Все дальнейшие исследования проводили в области Z ≤ 0.5 г хит./г жел., где формируются стехиометричные (био)ПЭК "желатина – хитозан".

Α

1,4

1,3

1,2

1,1

0,9

0,8

0,7

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

Z , г хит./г жел.

Рис. 2. Зависимость оптической плотности A смесей желатины с хитозаном в 0.1 М уксусной кислоте от массового соотношения биополимеров Z при титровании золя желатины (Cg = 1.0 %, Vg = 20.5 см3) золем хитозана (Cch = 2.0 %); λ = 400 нм, l = 5 см, t = 23 ºС

На рис. 3 представлена зависимость относительной вязкости η rel золей желатины от концентрации желатины С g (1), а также золей хитозана (2) и смесей желатины (1.0 %) с хитозаном (3) от концентрации хитозана С ch . Из рис. 3 видно, что с увеличением концентрации желатины (кривая 1) и концентрации хитозана (кривая 2) вязкость возрастает. Однако вязкость смесей желатины с хитозаном имеет несколько меньшие значения, чем вязкость золя хитозана без желатины в одной и той же области значений pH и концентрации полисахарида (рис. 3, кривые 2 и 3).

Такое понижение вязкости золей хитозана при внесении желатины можно объяснить следующим. Макромолекулы хитозана в кислой среде сильно вытянуты благодаря электростатическому отталкиванию положительно заряженных аминогрупп (см. рис. 1б). Это благоприятствует взаимной ориентации макромолекул и установлению межмолекулярных водородных связей, что в итоге приводит к высоким значениям вязкости золя хитозана ( Гамзадзе , 2002; Muzzarelli, Muzzarelli , 2009). В смеси же хитозана с желатиной отрицательно заряженные группы макромолекул желатины (остатки Glu и Asp ) блокируют положительные заряды аминогрупп хитозана, электростатически взаимодействуя с ними. Такой эффект напоминает влияние низкомолекулярных противоионов в солевых растворах хитозана, которое выражается в экранировании положительных аминогрупп и понижении вязкости ( Сафронов , 2002; Muzzarelli, Muzzarelli , 2009). По-видимому, модифицированные желатиной макромолекулы хитозана способны к образованию внутримолекулярных, а не только межмолекулярных связей.

На рис. 4 представлены УФ-спектры поглощения золей желатины (1.0 %) в уксусной кислоте с добавками хитозана разных концентраций. Там же для сравнения приведены спектры поглощения уксуснокислых золей биополимеров, взятых в отдельности: желатины (1.0 %, кривая 1) и хитозана (0.5 %, кривая 6). Наблюдается неаддитивное влияние хитозана на спектр поглощения желатины в кислой среде. При введении хитозана происходит батохромный сдвиг максимума поглощения желатины λ max с 234 нм до 237 нм независимо от концентрации хитозана. Максимальная оптическая плотность A max увеличивается при увеличении концентрации хитозана. В УФ-спектре золя хитозана длина волны максимальной оптической плотности (кривая 6) лежит в более коротковолновой области ( λ max = 224 нм).

A

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Рис. 3. Зависимость относительной вязкости η rel золей желатины в воде

(pH 4.8 + 4.9 = pI желатины) от концентрации желатины C g (1), а также золей хитозана (pH 3.1 + 3.9) (2) и желатины (1.0 %) с хитозаном (pH 3.2 + 3.9) (3) в уксусной кислоте от концентрации хитозана C ch

234 237

200    220    240    260    280    300    320    340    360

X , нм

Рис. 4. УФ-спектры поглощения золей желатины (1), желатины с хитозаном (2 + 5) и хитозана (6).

C g = 1.0 %; C ch , %: 0.2 (2), 0.3 (3), 0.4 (4), 0.5 (5, 6). pH 3.4 - 3.9

Батохромный сдвиг в спектре желатины можно объяснить электростатическим взаимодействием аминогрупп хитозана с типичными хромофорами, поглощающими излучение в области ближнего ультрафиолета – карбоксильными группами Glu и Asp ( Рабек , 1983). Полученные результаты подтверждают межмолекулярное взаимодействие желатины и хитозана в объеме золя в кислой области pH наряду с вискозиметрическими данными.

Подобные эффекты в золях желатины с другим полисахаридом – анионным биополимером к -каррагинаном авторы наблюдали в работе ( Маклакова и др. , 2014), используя метод ИК-спектроскопии. Было обнаружено, что благодаря электростатическому взаимодействию желатины с полисахаридом в ИК-спектре желатины возникает сдвиг A v = 2 см^-1 в низкочастотную область независимо от концентрации введенного к -каррагинана C car , при этом интенсивность полосы пропускания с ростом C car увеличивается.

На рис. 5 представлена зависимость эффективного радиуса частиц, определенного методом "спектра мутности", R ef в смесях желатины с хитозаном от концентрации хитозана C ch в кислой области pH. При увеличении C ch R ef возрастает от 45 нм ( C ch = 0 %) до 260 нм ( C ch = 0.5 %). Для сравнения, в золе хитозана без желатины при C ch = 0.5 % R ef = 120 нм, что указывает на неаддитивный характер укрупнения частиц в смесях желатины с хитозаном. Зависимость R ef от концентрации хитозана C ch в исследованном диапазоне при постоянной концентрации желатины C g = 1.0 % хорошо описывается экспоненциальной моделью:

R ef. = 52.3e 2.93 C ch , r = 0.954. (5)

Ранее установлено, что в гидрозолях желатины с анионными полисахаридами морского происхождения при pH = pI желатины в той же области соотношений желатины и полисахарида R ef частиц достигал гораздо больших значений: 920 нм для альгината натрия ( Воронько и др. , 2002) и 1400 нм для к -каррагинана (Деркач и др. , 2014). При этом R ef частиц в гидрозоле желатины (1.0 %) без полисахаридов при данном рН составлял 110 нм ( Деркач и др. , 2014).

C ch , г/ 100 см³

Рис. 5. Зависимость эффективного радиуса частиц R ef в золях желатины (1.0 %) с хитозаном от концентрации хитозана C_ch . pH 3.4 + 3.9

Образование частиц небольших размеров в случае хитозана можно объяснить влиянием уксусной кислоты. В кислой среде (pH 3.4 + 3.9 < pI) количество отрицательно заряженных остатков Glu и Asp желатины относительно невелико и практически все они вступают в электростатические взаимодействия с хитозаном. Дальнейшее укрупнение частиц в результате взаимодействия концевых цепей желатины по-видимому происходит в незначительной степени из-за отталкивания их положительных зарядов (остатки лизина Lys , гидроксилизина Hyl , гистидина His и аргинина Arg , число которых на 1000 аминокислотных остатков желатины составляет соответственно 22 + 28, 4 + 9, 4 + 11 и 47 + 49 ( Veis , 1964; Yannas , 1972; Haug, Draget , 2009)). В случае взаимодействия желатины в области pl с анионными полисахаридами альгинатом натрия или к -каррагинаном эффект взаимного отталкивания частиц отсутствует, так как на концевых цепях желатины остается достаточное количество как положительных, так и отрицательных зарядов.

Размер частиц дисперсной фазы, возникающих в объеме уксуснокислых золей желатины с хитозаном, оказывает непосредственное влияние на вязкость золей. На рис. 6 показана корреляция между относительной вязкостью золей желатины с хитозаном и эффективным радиусом R ef частиц дисперсной фазы золя. Зависимость n _rel от R ef (нм) частиц хорошо аппроксимируется квадратичной моделью:

n re, = KR ef , r = 0.924, (6) где K = 0.001.

Совместный анализ результатов вискозиметрических и спектрометрических исследований золей желатины с хитозаном, а также литературных данных, позволяет осветить общую картину формирования (био)полиэлектролитных комплексов в кислой среде (рис. 7).

Хитозан (Mη = 260 kDa) является более высокомолекулярным биополимером, чем желатина (Mη = 96 kDa). Макромолекулярные клубки в золях хитозана (Rf^ = 29 нм) значительно крупнее клубков в золе желатины (Ref ^ = 9 нм). При смешивании исходных кислых золей желатины и хитозана в объеме полученной смеси устанавливаются значения pH в диапазоне от 3.2 до 3.9 в зависимости от концентрации хитозана. В данной области pH ниже pI желатины, аминогруппы хитозана почти полностью ионизированы, а карбоксильные группы остатков Glu и Asp желатины ионизированы в незначительной степени. Это позволяет предположить, что с положительно заряженной матрицей – макромолекулой хитозана электростатически связывается несколько макромолекул желатины. Учитывая, что верхняя граница формирования стехиометричных (био)ПЭК соответствует соотношению Z = 0.78 г хит./г жел. (см. рис. 2) и зная молекулярные массы биополимеров, можно определить, что в среднем с одной макромолекулой хитозана связано от 3 до 4 макромолекул желатины.

Рис. 6. Корреляция между относительной вязкостью η rel и эффективным радиусом частиц R ef в уксуснокислых золях желатины с хитозаном. pH 3.4 + 3.9

Высокозаряженный хитозан вызывает дополнительную ионизацию карбоксильных групп желатины в кислой области pH ( Изумрудов , 2008). Это способствует образованию устойчивого (био)ПЭК "желатина – хитозан", в котором хитозан играет роль лиофилизирующего, а желатина – блокирующего полиэлектролита ( Зезин, Кабанов , 1982; Изумрудов и др. , 1991) или, соответственно, полиэлектролита-хозяина ( host-polyelectrolyte ) и полиэлектролита-гостя ( guest-polyelectrolyte ) ( Кабанов , 2005; Изумрудов , 2008). Так как в исследованной области массовых соотношений биополимеров ( Z ≤ 0.5 г хит./г жел.) формируются стехиометричные (био)ПЭК "желатина – хитозан" (см. рис. 2), все положительные заряды хитозана нейтрализованы отрицательными зарядами желатины. Поэтому макромолекулы хитозана испытывают тенденцию к формированию внутримолекулярных связей. Это может приводить к компактизации комплекса путем образования внутримолекулярных двойных спиралей лиофилизирующего полиэлектролита – хитозана ( Гамзадзе , 2002; Muzzarelli, Muzzarelli , 2009).

Образовавшиеся стехиометричные (био)полиэлектролитные комплексы "желатина – хитозан" в исследованной области соотношений биополимеров и рН имеют высокую плотность положительного заряда за счет ионизированных свободных концов макромолекул желатины. Поэтому в смесях желатины с хитозаном не наблюдалось фазового разделения и коацервации, что происходило бы, если бы стехиометричные комплексы не несли заряда ( Зезин , Кабанов , 1982; Изумрудов и др. , 1991).

4.    Заключение

Исследовано взаимодействие между макромолекулами хитозана и желатины при образовании (био)полиэлектролитных комплексов "желатина – хитозан" при постоянной концентрации желатины 1.0 % в диапазоне концентраций полисахарида от 0.03 до 0.5 % при pH от 3.2 до 3.9 (< pI желатины). Установлено, что в данном диапазоне массовых соотношений биополимеров и рН среды формируются стехиометричные комплексы. Методами капиллярной вискозиметрии, УФ-спектроскопии и дисперсии светорассеяния показано, что введение хитозана в золь желатины приводит к значительному увеличению относительной вязкости водных дисперсий и размера частиц дисперсной фазы. Корреляция между этими параметрами хорошо описывается квадратичной моделью.

Показано, что (био)полиэлектролитные комплексы "желатина – хитозан" формируются в результате электростатических взаимодействий между положительно заряженными аминогруппами хитозана и отрицательно заряженными аминокислотными остатками Glu и Asp желатины. Несмотря на стехиометричный состав образовавшихся (био)ПЭК во всем исследованном диапазоне массовых соотношений биополимеров не наблюдалось фазового разделения и коацервации благодаря высокой плотности положительного заряда на свободных концах макромолекул желатины.

Рис. 7. Качественная схема образования стехиометричных (био)ПЭК "желатина – хитозан" в кислой среде