Взаимоотношение экспрессии металлопротеиназ и TIMP1 с выраженностью воспалительной инфильтрации в шейке матки у женщин разных возрастных групп при интраэпителиальной неоплазии и микроинвазивной карциноме

Частота встречаемости инвазивного рака шейки матки (РШМ) остается достаточно высокой, несмотря на то, что данной проблеме уделяется повышенное внимание со стороны гинекологов, онкологов, патоморфологов, а для обследования и ведения пациенток разработаны алгоритмы, направленные на раннее выявление диспластических предопухолевых изменений (цервикальная интраэпителиальная неоплазия – CIN) и предотвращение развития опухоли.

В развитии дисплазии и РШМ играют роль различные этиологические факторы, в том числе инфекционные агенты, передаваемые половым путем, физические и химические факторы. На все повреждающие факторы возникает воспалительный ответ в шейке матки, сопровождающийся образованием клеточной инфильтрации разной степени выраженности, что может способствовать запуску механизмов инициации канцерогенеза, опухолевой прогрессии, ангиогенезу, опухолевой инвазии [1].

В настоящее время в онкоморфологии уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров опухолевой прогрессии, в том числе активно изучается роль матриксных металлопротеиназ (ММРs) [1–3], способных деградировать коллаген IV типа (основной компонент базальной мембраны) и другие компоненты внеклеточного матрикса [4, 5]. Также они обладают множеством других функций, в том числе способствуя пролиферации, миграции и дифференцировке клеток, могут играть роль в апоптозе, ангиогенезе, иммунном ответе, модулировать различные клеточные и сигнальные пути, играют важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса, способствуют разобщению межклеточных соединений [1, 6–9].

Регуляция ММРs осуществляется на нескольких уровнях, в том числе с помощью противодействующих им тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (TIMP) [10]. Известно, что MMPs продуцируются многими клетками: фибробластами, макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами, дермальными фибробластами, лейкоцитами, эндотелиальными клетками [11, 12], что определяет необходимость оценки их роли в условиях сочетания предопухолевых (диспластических) изменений и воспалительно-клеточной реакции, а также их баланс/дисбаланс с TIMP. Кроме того, на экспрессию ММРs могут оказывать влияние половые гормоны [2, 13], что актуально в рассмотрении особенностей экспрессии ММР и TIMP в разных возрастных группах женщин, имеющих CIN и микрокарциному ШМ, поскольку научных исследований, посвященных данному аспекту, не встречено.

Цель исследования – изучить экспрессию MMPs и TIMP1, а также патоморфологические особенности воспалительной реакции в строме шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и микроинвазивной карциноме у пациенток различных возрастных групп.

Материал и методы

Проведены морфологическое, морфометрическое и иммуногистохимическое исследования биоптатов шейки матки с диспластическими изменениями и микроинвазивной карциномой пациенток двух возрастных групп: 1-я группа (n=95) – пациентки раннего репродуктивного возраста от 18 до 35 лет (средний возраст – 28,5 ± 0,58 года), 2-я группа (n=85) – женщины пострепродуктивного (перименопаузального и менопаузального) возраста – от 49 до 65 лет (средний возраст – 55,4 ± 0,98 года). Каждая из вышеуказанных возрастных групп была разделена на подгруппы: пациентки с CIN1, CIN2, CIN3 и пациентки с микроинвазивной карциномой (глубина инвазии до 3 мм).

Проводили микроскопическую оценку гистологических препаратов, приготовленных по стан- дартной методике, окрашенных гематоксилином и эозином. При оценке изменений в шейке матки диагноз CIN разной степени выраженности и микроинвазивной карциномы формулировали в соответствии с общепринятыми морфологическими критериями оценки многослойного плоского эпителия и стромы [14, 15]. Исследовали объемную плотность (Vv) и клеточный состав воспалительной инфильтрации (%) в строме шейки матки.

Методом иммуногистохимии оценивали уровень экспрессии представителей семейства MMPs: ММР-2, -3, -7 и -9 с помощью антител: Anti-ММР-2 antibody – (клон 4D3, mouse monoclonal, «Abcam», Англия); Anti-ММР-3 antibody – (клон EP1186Y, mouse monoclonal, «Abcam», Англия); Anti-ММР-7 antibody – (клон EPR17888-101, mouse monoclonal, «Abcam», Англия); Anti-human MMP-9 antibody (клон EP127, rabbit monoclonal, EPITOMICS an abcam company, USA). Проводили оценку экспрессии универсального тканевого ингибитора металлопротеиназ – TIMP-1 (TIMP-1 antibody – (клон 102D1, mouse monoclonal, «GeneTex», USA). Иммуноморфологическое окрашивание выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах по иммуногистохимическим исследованиям [16] в аппарате Autostainer Link 48. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой (EnVision FLEX, «DAKO» Дания). Последним этапом докрашивали ядра клеток гематоксилином.

При исследовании препаратов, окрашенных антителами, оценивали позитивное цитоплазматическое окрашивание клеток стромы и воспалительного инфильтрата, рассчитывали индекс мечения соответствующего маркера как отношение числа позитивно окрашенных клеток на 100 клеток (%).

Достоверность различий сравниваемых величин оценивали по критерию Стьюдента (р≤0,05).

Результаты исследования

При оценке воспалительных изменений в строме шейки матки выявлено, что объемная плотность воспалительного клеточного инфильтрата у женщин репродуктивного возраста (1-я возрастная группа) при всех степенях диспластических изменений и с микроинвазивной карциномой была достоверно выше, чем у женщин 2-й группы, и увеличивалась с нарастанием CIN вплоть до микроинвазивной карциномы (рис. 1).

У пациенток пострепродуктивного возраста этот показатель также увеличивался при нарастании степени CIN до микроинвазивной карциномы, но был достоверно ниже, чем у молодых женщин, – в 2; 2,1; 2,2 и 1,4 раза соответственно. Более значительная выраженность перифокальной воспалительной реакции у молодых женщин, вероятно, обусловлена более частым наличием инфекционных агентов, так как они являются группой сексуально активного населения [17], а также с более активными иммунными реакциями, регулируемыми стероидными гормонами, в то время как у пациенток старшей возрастной группы имеет место противоположная картина (рис. 1), и это может быть связано со снижением гормональной насыщенности ткани.

Морфометрический анализ клеточного состава воспалительного инфильтрата выявил, что у женщин обеих групп при всех степенях CIN и при микроинвазивной карциноме при примерно одинаковом содержании макрофагов наибольшую долю составили лимфоидные клетки (лимфоциты и плазмоциты) (табл. 1), содержание которых в сумме было около 40 % от всех клеток у женщин обеих возрастных групп. При этом установлено, что содержание лимфоцитов значительно не различалось во всех подгруппах, а доля плазматических клеток варьировала. У пациенток обеих групп нарастание степени CIN сопровождалось поступательным увеличением доли плазматических клеток, однако в целом этот показатель у женщин старшей возрастной группы был ниже, чем в 1-й группе. В составе воспалительной инфильтрации содержание нейтрофилов и эозинофилов было невысоким в обеих группах, однако в целом суммарно доля этих клеток у пациенток репродуктивного возраста была выше во всех подгруппах (табл. 1).

Обращает внимание, что максимальные различия показателей были при CIN3 и микроинвазивной карциноме, когда у женщин 1-й группы суммарное содержание нейтрофилов и эозинофилов достигло максимальных значений – 20,1 и 14,4 %, а у пациенток 2-й группы было ниже – 3,1 и 6,01 % соответственно. Отмеченная тенденция свидетельствует о большей активности перифокальной воспалительной реакции в строме шейки матки в более молодом возрасте, что согласуется с рядом исследований.

Доля фибробластов из общего состава клеток инфильтрата, напротив, была выше при всех сте-

Рис. 1. Соотношение величин объемных плотностей воспалительной клеточной инфильтрации в группе женщин моложе 35 лет и старше 49 лет с CIN разной степени выраженности и с микроинвазивной карциномой

Таблица 1

Сравнительная характеристика результатов морфометрического исследования клеточного состава воспалительного инфильтрата в группах женщин разных возрастов с СIN разной степени выраженности и микроинвазивной карциномой

Молодые женщины (1-я группа) (n=89)         Женщины старшего возраста (2-я группа) (n=71)

Показатель	CIN1 (n=24)	CIN2 (n=20)	CIN3 (n=25)	Микро-инвазивная карцинома (n=20)	CIN1 (n=30)	CIN2 (n=10)	CIN3 (n=17)	Микро-инвазивная карцинома (n=14)
Лимфоциты	29,7 ± 0,9*	27,8 ± 1*	24,5 ± 0,6	24,6 ± 0,7*	28,5 ± 1,1*	25,3 ± 1,5*	24,5 ± 1,5	35,9 ± 0,5*
Макрофаги	26,3 ± 1*	28,9 ± 1*	22 ± 0,5*	23,6 ± 0,8*	24,3 ± 0,9*	20,9 ± 1*	30 ± 1,1*	18,2 ± 0,5*
Нейтрофилы	3,9 ± 0,4*	3,3 ± 0,4	14 ± 0,5*	2,6 ± 0,3*	3,1 ± 0,3*	3,01 ± 0,5	1,3 ± 0,2*	1,01 ± 0,2*
Эозинофилы	4 ± 0,6*	2,9 ± 0,5	5,7 ± 0,4*	11,8 ± 0,4*	1,3 ± 0,3*	2,5 ± 0,4	1,8 ± 0,5*	5 ± 0,5*
Плазмоциты	11 ± 0,8	12,4 ± 0,7	19 ± 0,5*	24 ± 0,8*	9 ± 0,5	11,6 ± 0,8	7,8 ± 0,5*	14,1 ± 0,8*
Фибробласты	24,9 ± 1,3*	24 ± 1,8*	13,5 ± 1*	13,4 ± 0,5*	33,5 ± 1,4*	37 ± 1,8*	34 ± 1,6*	25,9 ± 0,9*

Примечание: * – значимость различий средних величин рассматриваемых параметров между сравниваемыми значениями в 1-й и 2-й группах по критерию Стьюдента (р≤0,05).

пенях CIN и при микроинвазивной карциноме у пациенток 2-й группы – в 1,3, 1,5, 2,5 и 1,9 раза соответственно, что указывает на более активные процессы фибротизации у женщин старшего возраста.

При оценке экспрессии ММРs установлено, что в обеих группах пациенток с нарастанием степени дисплазии, вплоть до микроинвазивной карциномы, увеличивалась экспрессия ММР9 и ММР2 (табл. 2), что, вероятно связано с нарастанием атипии, перестройкой эпителия и биохимическими изменениями прилежащей стромы, которая начинает продуцировать различные ростовые факторы, такие как эпидермальный ростовой фактор, сосудистый ростовой фактор, а они, в свою очередь, индуцируют экспрессию ММРs. Также установлено, что у молодых женщин уровень экспрессии ММР9 был достоверно выше во всех подгруппах от CIN I до микроинвазивной карциномы – в 4,7; 2,0; 1,5 и в 1,3 раза соответственно (рис. 2) в сравнении с женщинами пострепродуктивного возраста (рис. 3). Наряду с этим у женщин первой возрастной группы экспрессия ММР2 также была достоверно выше начиная с CIN2 и до микроинвазивной карциномы – в 5; 1,2 и в 1,5 раза соответственно.

При этом установлено, что ММР7 экспрессировалась в самых минимальных значениях при всех степенях СIN и при микроинвазивной карциноме у женщин обеих возрастных групп (табл. 2), и этот показатель также увеличивался параллельно с прогрессированием степени дисплазии как у молодых женщин, так и у женщин пострепродуктивного возраста, не имея достоверных различий между группами.

Известно, что ММР3 может оказывать влияние на экспрессию ММР9 и ММР7, способствуя их активации. В настоящем исследовании установлено, что экспрессия ММР3 в строме шейки матки повышалась с нарастанием диспластических изменений в многослойном плоском эпителии в обеих возрастных группах. И на фоне нарастания этого показателя в обеих группах выявлено достоверно более значимое увеличение экспрессии ММР3 у женщин молодого возраста при всех степенях дис-пластических изменений – в 1,7; 2,0 и в 1,7 раза соответственно, однако при микроинвазивной карциноме этот показатель достоверно не различался в обеих возрастных группах (табл. 2).

Любой из белков семейства TIMP поддерживает разные про-ММР в неактивном состоянии

Рис. 2. Микрофото. Индекс мечения экспрессии ММР9 клетками воспалительного инфильтрата в строме шейки матки с микроинвазивной карциномой у женщины репродуктивного возраста, ×200

Рис. 3. Микрофото. Индекс мечения экспрессии ММР9 клетками воспалительного инфильтрата в шейке матки с микро-инвазивной карциномой у женщины перименопаузального возрастного периода, ×400

Таблица 2

Сравнительная характеристика результатов иммуногистохимического исследования (индекс мечения) экспрессии матриксных металлопротеиназ и TIMp1 в группах женщин различных возрастных периодов с СIN разной степени выраженности и микроинвазивной карциномой

Показатель	Молодые женщины (1-я группа) (n=89)				Женщины старшего возраста (2-я группа) (n=71) Микро-
	CIN1 (n=24)	CIN2 (n=20)	CIN3 (n=25)	Микро-инвазивная карцинома (n=20)
					CIN1 (n=30)	CIN2 (n=10)	CIN3 (n=17)	инвазивная карцинома (n=14)
ММР2	2,1 ± 0,4	20,3 ± 0,8*	23,2 ± 0,4*	31,5 ± 1,7*	2,0 ± 0,3	4 ± 1*	18,7 ± 1,4*	20,3 ± 1,3*
ММР3	16,2 ± 0,5*	18,4 ± 0,8*	19,5 ± 1,1*	23,03 ± 1*	9,3 ± 0,8*	9,6 ± 1*	11,4 ± 1*	20,5 ± 0,8*
ММР7	0,07 ± 0,01*	0,2 ± 0,1	0,5 ± 0,04	1,3 ± 0,2	0,03 ± 0,01*	0,2 ± 0,4	0,4 ± 0,1	1,13 ± 0,4
ММР9	10,5 ± 2*	13,7 ± 0,5*	15,4 ± 1,2*	18,3 ± 1,3*	2,2 ± 0,4*	6,4 ± 1*	10,4 ± 1,4*	13,8 ± 1,3*
TIMP1	2,6 ± 0,08*	0,5 ± 0,01	0,4 ± 0,02*	0,04 ± 0,01*	0,1 ± 0,06*	0,4 ± 0,1	1,5 ± 0,3*	1,7 ± 0,4*

Примечание: * – значимость различий средних величин рассматриваемых параметров между сравниваемыми значениями в 1-й и 2-й группах по критерию Стьюдента (р≤0,05).

[18] и считается, что нарушение баланса между ферментом и его ингибитором может приводить к активности MMPs [19]. Установлено, что у женщин репродуктивного возраста уровень экспрессии универсальной TIMP1 в клетках стромы и воспалительного инфильтрата снижался с нарастанием дисплазии. Так, данный показатель снизился примерно в 5 раз – с 2,6 % при CIN1 до 0,4 % при CIN3 (рис. 4) – и достигал минимальных значений при микроинвазивной карциноме, уменьшившись в 60 раз (встречались крайне редкие единичные позитивно окрашенные клетки). Напротив, у женщин пострепродуктивного возраста этот показатель от CIN1 до микроинвазивной карциномы увеличился в 17 раз – достигнув значения 1,7 % (рис. 5).

Обсуждение

Как известно, ММР могут синтезироваться клетками воспаления, в исследовании получено, что доля лимфоцитов в составе воспалительного инфильтрата в шейке матки была выше в соотношении с другими клетками у женщин всех подгрупп, при этом именно лимфоциты продуцируют воспалительные цитокины, которые стимулируют продукцию ММР [20]. В строме шейки матки в обеих возрастных группах с нарастанием степени дисплазии вплоть до микроинвазивной карциномы нарастала объемная плотность воспалительного инфильтрата, при этом у молодых женщин воспалительный процесс был более выражен и активен, в сравнении с женщинами пострепродуктивного возраста, а, следовательно, они имели и более высокий клеточный потенциал для синтеза MMPs.

Кроме того, установлено достоверное нарастание экспрессии MMPs с прогрессированием диспластических изменений в обеих возрастных группах, и данный показатель также был достоверно выше у молодых женщин в каждой подгруппе, что, видимо, ассоциировано с более выраженным и активным воспалительным процессом в строме шейки матки у них.

Иммунная воспалительная инфильтрация в шейке матки играет роль защитной реакции в условиях HPV-инфекции и одновременно является проявлением противоопухолевого иммунитета в условиях появления атипичных клеток в процессе прогрессирования дисплазии. Но наряду с защитными механизмами воспаление может оказывать проинвазивный эффект, индуцируя расщепление внеклеточного матрикса металлопротеиназами [6, 8]. Кроме того, необходимо учитывать, что у женщин молодого возраста гормональная насы-

Рис. 4. Микрофото. Индекс мечения экспрессии TIMP1 клетками воспаления в строме шейки матки у женщин репродуктивного возраста, ×400

Рис. 5. Микрофото. Индекс мечения экспрессии TIMP1 клетками воспаления в строме шейки матки у женщины периме-нопаузального возрастного периода, ×400

щенность тканей значительно выше, что в совокупности с более высокой инфекционной нагрузкой [13] обусловливает более выраженные и активные иммунные реакции, что и способствует более высокому уровню синтеза MMPs.

ТIMP1 является универсальным ингибитором MMPs [21, 22], в частности, ММР9, находясь в связанном состоянии с TIMP1, является неактивной, но при воздействии ММР3 эта связь нарушается, активируя ее синтез. В настоящем исследовании установлено, что экспрессия TIMP1 была достоверно выше у пациенток старшего возраста и нарастала с прогрессированием патологических изменений, а у женщин репродуктивного возраста отмечены противоположные результаты. Соответственно, более высокий уровень экспрессии TIMP1 у женщин старшего возраста может являться одним из факторов, способствующих более низкой экспрессии синтеза MMPs у них. Возможно, когда уровень MMPs превышает некое «пороговое» значение, происходит снижение экспрессии TIMP1, и это, вероятно, связано с тем, что он расходуется и перестает синтезироваться в нужном количестве у женщин молодого возраста, таким образом, способствуя деградации внеклеточного матрикса металлопротеиназами, проявляя их проинвазивный потенциал. Поэтому большая выраженность воспалительных реакций у молодых женщин – прогностически плохой признак, ассоциированный с облегчением инвазии при интраэпителиальной неоплазии и вероятного более быстрого метастазирования у женщин с инвазивной карциномой. Данные результаты подтверждаются рядом исследований, которые подчеркивают более высокую заболеваемость РШМ у молодых женщин и более агрессивное течение заболевания у них [23].