Взаимосвязь цитокинового профиля мононуклеаров и эндотелиальных прогениторных клеток, полученных в результате мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, у пациентов с хронической сердечной недостаточностью

Клеточные технологии активно используют в лечении многих заболеваний, особенно сердечно-сосудистых, смертность от которых непрерывно увеличивается. Стволовые/прогениторные клетки для клинического применения можно получить различными способами: выделить из костного мозга, жировой ткани или, что менее травматично, периферической крови, предварительно проведя мобилизацию гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF, granulocyte-colony stimulating factor) клеток в кровь [1]. Многие авторы считают, что эффективность лечения стволовыми/прогениторными клетками обусловлена в первую очередь их паракринным действием путем секреции различных ростовых факторов и цитокинов [2–4]. Локальные сигнальные молекулы, полный список которых еще предстоит определить, способствуют неоангиогенезу и влияют на образование сосудистых структур. Кроме того, они способны регулировать локальное воспаление и оказывать антиапоптотическое действие. Паракринные сигналы также влияют на внеклеточный матрикс и активируют соседние резидентные стволовые/ прогениторные клетки [5].

Для стимуляции регенерации, особенно индукции ангиогенеза в ишемизированных и поврежденных тканях при сердечно-сосудистой патологии, необходимо влияние биологически активных веществ, в том числе цитокинов и ростовых факторов [6].

В некоторых исследованиях показано, что ство-ловые/прогениторные клетки костного мозга продуцируют широкий спектр ростовых факторов с проан-гиогенным действием: ангиопоэтин-1, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), HGF, FGF, TGF- β , интерлейкин (IL-1), IL-6, IL-10, IL-18, фактор некроза опухоли α (TNF- α ), белок хемоаттрактант моноцитов, ростовые факторы (GM-CSF, G-CSF) и др. [7, 8]. При этом спектр продуцируемых цитокинов и ростовых факторов исследовали у общей популяции клеток костного мозга, которая кроме эндотелиальных прогениторных клеток содержит гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки. Данные о продуцирующей активности циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток немногочисленны и преимущественно относятся к определению секрета адгезивных культивируемых в ранние сроки клеток. Группа ученых под руководством J. Rehman исследовала уровень проангиогенных секреторных факторов эндотелиальных прогениторных клеток. Адгезивная фракция эндотелиальных прогенитор-ных клеток, экспрессирующая моноцитарные маркеры, не отличается высоким пролиферативным потенциалом и секретирует ростовые факторы – VEGF, HFG, G-CSF,

GM-CSF [9]. Другие авторы показали, что кондиционная среда при культивировании эндотелиальных проге-ниторных клеток доноров содержит VEGF, G-CSF, IL-8 и IL-17, при этом возраст не влияет на уровень секреции данных цитокинов [10].

Популяция CD34⁺/CD133⁺ эндотелиальных прогенитор-ных клеток мышей экспрессирует несколько изоформ VEGF, кроме того при культивировании значительно увеличивается экспрессия VEGF-120 и VEGF-164 [11]. Спектр продуцируемых эндотелиальными прогениторными клетками биологически активных молекул преимущественно относится к факторам роста, а цитокинпродуцирующая активность исследована недостаточно.

Цель исследования – оценить цитокинпродуциру-ющую способность мононуклеарных клеток, обогащенных эндотелиальными прогениторными клетками, и ее корреляцию с выходом эндотелиальных проге-ниторных клеток в процессе мобилизации G-CSF у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН).

Материал и методы

Исследовали 35 пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца с III–IV функциональным классом ХСН по классификации Нью-йоркской ассоциации сердца (NYHA), подписавших информированное согласие, в соответствии с протоколами, которые утвердили этические комитеты и ученые советы учреждений соисполнителей (протокол № 5 от 02.06.2008 – НИИКЭЛ; № 26 от 24.02.2009 – ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина).

Средний возраст пациентов составил 57,0±7,6 года, 89% – мужчины. Длительность заболевания ишемической болезнью сердца – 7,94±5,86 года, количество перенесенных инфарктов миокарда – 1,59±0,77. Пациенты проходили обследование и плановое хирургическое лечение в центре интервенционной кардиологии НИИ патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина.

Мобилизацию мононуклеарных клеток в периферическую кровь проводили путем введения пациентам рекомбинантного человеческого G-CSF (Grasalva, Израиль) подкожно в дозе 3,3–5,0 мкг/кг веса в сутки общим количеством 5 инъекций. До и после мобилизации G-CSF у пациентов забирали венозную кровь. На шестые сутки пациентам проводили процедуру аппаратного цитафереза на сепараторе клеток крови (Haemonetics MCS⁺, США). Использовали программу PBSC (получение периферических стволовых клеток). Мононукле-ары из сепарированной крови выделяли на градиенте плотности фиколла-верографина ( ρ = 1,078 г/л), дважды отмывали в забуференном физиологическом растворе,

Таблица 1 Показатели концентрации цитокинов и ростовых факторов в кондиционных средах мононуклеарных клеток до и после завершения мобилизации G-CSF у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (n = 35)

Цитокины (Me; LQ–HQ) До мобилизации После мобилизации спонтанная секреция конканавалин А липополисахарид спонтанная секреция конканавалин А липополисахарид TNF-α, пг/мл 102,3 (100–175) 420,4 (172–1 376) 644,3 (405–900) 33,0 (23–85), р = 0,0003 278,3 (188–738), р = 0,59 240,3 (130–370), р = 0,14 67,7 (57–101) 570,6 (101–746) 534,7 (345–694) 72,1 484,6 680,3 IL-10, пг/мл (22–102), р = 0,72 (101–748), р = 0,47 (102–119), р = 0,75 33,0 (18–102) 58,1 (50–64) 39,2 (36–40) 103,2 197,3 147,2 IL-18, пг/мл (67–135), р = 0,034 (102–374), р = 0,017 (102–256), р = 0,0004 IL-8, пг/мл 732,9 (103–965) 1550,3 (147–4 450) 1425,0 (120–4 000) 735,7 (103–822), р = 0,31 740,2 (420–4 805), р = 0,09 735,1 (350–4 065), р = 0,14 27,2 (17,8–101) 215,7 (161–277) 234,8 (171–240) 102,2 213,5 162,5 Epo, МЕ/мл (36–306), р = 0,008 (130–289), р = 0,67 (129–223), р = 0,63 G-CSF, пг/мл 13,1 (10–101) 135,5 (127–165) 16,1 (15–18) 11,0 (10–30), р = 0,3 967,4 (769–1 010), р = 0,0007 940,3 (763–3 332), р = 0,0007 VEGF, пг/мл 256,2 (102–450) 293,5 (256–300) 448,4 (432–458) 298,1 (113–340), р = 0,03 300,2 (287–339), р = 0,56 386,7 (211–470), р = 0,09 p – достоверность различий по сравнению с показателями продукции цитокинов до введения G-CSF подсчитывали количество, жизнеспособность выделенных клеток. Фенотип эндотелиальных прогениторных клеток исследовали с использованием моноклональных антител, меченных FITC и PE к CD34, CD45, CD133, VEGFR2, CD31, CD14 (Becton Dickinson, США) на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США) согласно инструкции производителя. Уровень продукции цитокинов изучали в кондиционных средах от 72-часовых культур мононуклеарных клеток как в спонтанном, так и стимулированных тестах (5 мкг/мл конканавалина А, США; 10 мкг/мл липополисахарида, США), а также в присутствии G-CSF (50 Ед/мл; Grasalva, Израиль) и эритропоэтина (33 Ед/мл; Рекормон, США). Аликвоты собранных кондиционных сред замораживали и хранили при –20 °С до тестирования. Содержание в кондиционной среде TNF-α, IL-8, IL-10, IL-18, VEGF, Epo и G-CSF определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирская область, Россия) согласно инструкции фирмы-производителя. Индекс стимуляции секреторного уровня рассчитывали как соотношение оптической плотности продукта реакции в опыте к оптической плотности продукта реакции в контроле. Полученные результаты исследования статистически обрабатывали с использованием программного пакета Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно критериям Колмогорова – Смирнова, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Me), нижним (25% LQ) и верхним (75% HQ) квартилями. Достоверность различий оценивали по критериям Манна – Уитни. Взаимосвязь явлений устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Мононуклеарные клетки (МНК) у пациентов с ХСН конститутивно продуцируют регуляторные цитокины и ростовые факторы (табл. 1), причем уровень секреции VEGF, IL-8 и TNF- α в спонтанных условиях был наиболее высоким. Продукция МНК TNF- α , IL-10, IL-8 и Epo стимулировалась как Т-клеточным митогеном конкана-валином А, так и липополисахаридом – митогеном для клеток моноцитарного ряда. Продукция G-CSF и IL-18

Таблица 2 Показатели концентрации цитокинов и ростовых факторов в кондиционных средах мононуклеарных клеток до и после мобилизации G-CSF у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (n = 35)

До мобилизации                                  После мобилизации

Цитокины (Me; LQ–HQ) Спонтанная секреция Секреция, стимулированная G-CSF Индекс стимуляции Спонтанная секреция Секреция, стимулированная G-CSF Индекс стимуляции TNF-α, пг/мл 102,3 (100–175) 80,5 (55–110) р = 0,09 0,8 33,0 (23–85) 425,5 (208–888) р = 0,0004 12,8 IL-10, пг/мл 67,7 (57–101) 525,2 (338–650) р = 0,01 7,7 72,1 (22–102) 1294,3 (990–1 520) р = 0,004 17,9 IL-18, пг/мл 33,0 (18–102) 181,2 (167–198) р = 0,009 5,4 103,2 (67–135) 235,4 (113–274) р = 0,02 2,2 IL-8, пг/мл 732,9 (103–965) 3115,4 (2 980–3 345) р = 0,008 4,2 735,7 (103–822) 1729,7 (357–3 586) р = 0,18 2,3 Epo, МЕ/мл 27,2 (18–101) 90,3 (80–101) р = 0,009 3,0 102,2 (35–306) 176,5 (132–201) р = 0,9 1,7 VEGF, пг/мл 256,2 (102–450) 172,9 (156–180) р = 0,009 0,7 298,1 (113–340) 298,3 (240,5–389) р = 1,0 1,0 p – достоверность различий по сравнению с показателями спонтанной продукции цитокинов и ростовых факторов

МНК увеличилась при стимуляции конканавалином А, а VEGF – липополисахаридом. После окончания мобилизации МНК, обогащенные эндотелиальными про-гениторными клетками, уменьшали продукцию двух цитокинов – TNF- α и G-CSF – по сравнению с продукцией до мобилизации G-CSF, но статистически значимо уменьшался только уровень TNF- α . В то же время уровень секреции IL-18, Epo и VEGF статистически значимо увеличился, а IL-8 и IL-10 сохранялся после мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором.

Функциональный резерв мобилизованных МНК, содержащих эндотелиальные прогениторные клетки, в виде ответа на митогенные стимулы оставался высоким, за исключением продукции VEGF и IL-8 после мобилизации.

Аутокринные и межклеточные паракринные взаимодействия во многом определяют функциональное состояние клеток, поэтому далее изучали влияние внешних цитокиновых стимулов на секреторную активность МНК пациентов с ХСН до и после введения G-CSF. Использовали G-CSF и Epo в качестве стимулятора культуры МНК до введения G-CSF пациентам и культуры МНК, обогащенной эндотелиальными прогенитор-ными клетками. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo показано, что данные цитокины обладают проангиогенными свойствами [12, 13].

Добавление в культуру МНК in vitro , полученную до процедуры мобилизации у пациентов, ростового фактора G-CSF приводит к статистически значимому увеличению продукции IL-10, IL-18, IL-8 и Epo и снижению уровня VEGF (табл. 2). После мобилизации добавление G-CSF в культуру МНК статистически значимо стимулирует секрецию трех цитокинов – TNF- α , IL-10 и IL-18, при этом уровень секреции VEGF остается неизменным.

Добавление Epo в культуру МНК in vitro , полученную до мобилизации G-CSF, как и культивирование МНК с G-CSF, приводят к повышению секреции трех цитокинов – IL-10, IL-18 и IL-8. Уровень секреции G-CSF и VEGF остается неизменным (табл. 3). Добавление Epo к культивируемым МНК, обогащенным эндотелиальными прогениторными клетками путем мобилизации, повышает продукцию всех анализируемых цитокинов. Только Epo увеличивает секрецию VEGF в культуре, стимулированной введением G-CSF пациентам. G-CSF и Epo стимулируют сниженную продукцию TNF- α после мобилизации.

По данным литературы, TNF- α , провоспалительный цитокин, обладает и ангиогенными свойствами [14].

Таблица 3 Показатели концентрации цитокинов и ростовых факторов в кондиционных средах мононуклеарных клеток до и после мобилизации G-CSF у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (n = 35)

До мобилизации                                  После мобилизации

Цитокины (Me; LQ–HQ) Спонтанная секреция Секреция, стимулированная эритропоэтином Индекс стимуляции Спонтанная секреция Секреция, стимулированная эритропоэтином Индекс стимуляции TNF-α, пг/мл 102,3 (100–175) 100,2 (99–101), р = 0,09 1,0 33,0 (23–85) 990,3 (792–1 298), р = 0,0004 30,1 IL-10, пг/мл 67,7 (57–101) 294,5 (189–300), р = 0,006 4,3 72,1 (22–102) 895,4 (790–1 190), р = 0,001 12,4 IL-18, пг/мл 33,0 (18–102) 399,4 (212–415), р = 0,04 12,1 103,2 (67–135) 190,5 (104–228), р = 0,039 1,8 IL-8, пг/мл 732,9 (103–965) 3 840,7 (2 890–4 160), р = 0,009 5,2 735,7 (103–822) 1 578,8 (348–3 100), р = 0,008 2,1 G-CSF, МЕ/мл 27,2 (18–101) 8,5 (7–10), р = 0,06 0,6 102,2 (35–306) 865,5 (586–3 660), p = 0,0004 78,6 VEGF, пг/мл 256,2 (102–450) 253,4 (219–270), р = 0,06 1,0 298,1 (113–340) 327,0 (278–492), р = 0,03 1,1 p – достоверность различий по сравнению с показателями спонтанной продукции цитокинов и ростовых факторов

Индекс стимуляции секреторной активности МНК, полученных до мобилизации, был наиболее высоким для IL-10, IL-18, IL-8 при стимулировании как G-CSF, так и Epo. После мобилизации G-CSF и Epo обладали максимальной стимулирующей активностью в отношении TNF- α и IL-10, а Epo стимулировал и продукцию G-CSF. Таким образом, добавление G-CSF в культуру МНК пациентов после мобилизации статистически значимо стимулирует продукцию трех цитокинов – TNF- α , IL-10 и IL-18, а культивирование МНК с Epo увеличивает продукцию еще IL-8, G-CSF и VEGF. Полученные данные свидетельствуют о паракринных взаимодействиях и возможном аутокринном влиянии указанных цитокинов, продуцируемых МНК, обогащенными эндотелиальными прогениторными клетками.

Далее выяснили участие различных популяций эндотелиальных прогениторных клеток в продукции цитокинов при мобилизации G-CSF. Результаты корреляционного исследования взаимосвязи абсолютного количества различных популяций циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток и конститутивного уровня цитокинов в кондиционных средах при культивировании МНК после мобилизации G-CSF представлены в табл. 4.

Установили высокую и прямую взаимосвязь количества эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34^–/CD133⁺ в периферической крови у пациентов с ХСН после мобилизации G-CSF и продукции TNF- α (R = 0,729; p = 0,02). Между продукцией IL-18 и количеством в крови эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34⁺/VEGFR^–₂ и с фенотипом CD34⁺/VEGFR⁺₂ имеется прямая и высокая зависимость (R = 0,7; p = 0,03 и R = 0,82; p = 0,01 соответственно). Продукция Epo имела высокую и прямую сопряженность с количеством эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34^–/VEGFR2⁺ среди мононукле-арных клеток у пациентов с ХСН после мобилизации G-CSF. Кроме того, установили взаимосвязь количества эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34⁺/CD31⁺ с продукцией VEGF, которая носила прямой и сильный характер. Также установили высокую и прямую сопряженность количества эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34^–/CD31⁺ с продукцией IL-10 (R = 0,9; p = 0,03).

Таким образом, можно предположить, что эндотелиальные прогениторные клетки практически всех анализируемых фенотипов (CD34–/CD133+, CD34+/ VEGFR–2, CD34+/VEGFR2, CD34–/VEGFR+2, CD34+/

Таблица 4 Показатели взаимосвязи количества эндотелиальных прогениторных клеток в периферической крови и продукции цитокинов и ростовых факторов после мобилизации G-CSF (n = 35)

Популяции эндотелиальных прогениторных клеток	TNF- α	Анализируемые цитокины и ростовые факторы
		IL-10	IL-18	Epo	VEGF
CD34–/CD133+	R = 0,729,	R = 0,16,	R = –0,17,	R = 0,24,	R = 0,24,
	p = 0,02	p = 0,67	p = 0,65	p = 0,51	p = 0,51
CD34+/VEGFR2–	R = 0,25,	R = 0,22,	R = 0,7,	R = 0,3,	R = 0,05,
	p = 0,51	p = 0,55	p = 0,03	p = 0,4	p = 0,89
CD34+/VEGFR2+	R = 0,4,	R = 0,32,	R = 0,82,	R = –0,4,	R = –0,3,
	p = 0,3	p = 0,44	p = 0,01	p = 0,3	p = 0,42
CD34–/VEGFR2+	R = 0,42,	R = –0,4,	R = 0,1,	R = 0,86,	R = –0,21,
	p = 0,7	p = 0,29	p = 0,19	p = 0,005	p = 0,58
CD34+/CD31+	R = –0,3,	R = 0,8,	R = 0,5,	R = –0,7,	R = 0,9,
	p = 0,62	p = 0,1	p = 0,39	p =0,18	p = 0,03
CD34–/CD31+	R = –0,1,	R = 0,9,	R = 0,6,	R = 0,6,	R = 0,7,
	p = 0,87	p = 0,03	p = 0,28	p = 0,28	p = 0,28

CD31+, CD34–/CD31) участвуют в продукции цитокинов, обладающих выраженной проангиогенной активностью.

Выводы

Мононуклеарные клетки периферической крови у пациентов с ХСН продуцируют цитокины и ростовые факторы с проангиогенным действием. Обогащение периферической крови эндотелиальными прогенитор-ными клетками в результате мобилизации G-CSF у пациентов с ХСН приводит к увеличению секреции МНК цитокинов с проангиогенной активностью – IL-18, Epo и VEGF – и возрастанию функционального резерва продукции мононуклеарными клетками G-CSF. Мобилизация эндотелиальных прогениторных клеток G-CSF ведет к снижению секреции МНК провоспалительно-го цитокина TNF- α . При этом эндотелиальные проге-ниторные клетки вносят вклад в продукцию таких цитокинов и ростовых факторов, как TNF- α , IL-18, IL-10, Epo, VEGF.

Результаты исследования свидетельствуют о возможности использования мононуклеарных клеток, полученных в результате мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, для лечения хронической сердечной недостаточности.