Взаимосвязь клинико-морфологических параметров и выживаемости при аденокарциноме легкогос активностью ядрышковых организаторов в MIB-1 позитивных клетках

Кобяков Дмитрий Сергеевич (Kobyakov Dmitriy Sergeevich) – кандидат медицинских наук, врач патологоанатом,

Введение

Аденокарцинома легких составляет не менее трети от всех гистологических типов неоплазии этой локализации. На сегодняшний день актуальным является изучение морфологических критериев, связанных с важнейшими клинико-морфологическими параметрами аденокарциномы легкого и выживаемостью больных, способными с большой долей вероятности прогнозировать течение заболевания.

Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое определение антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю G1, S, G2, М фазы, однако, функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно [10]. Маркером скорости клеточного цикла являются аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки) – два основных белка С23 (нуклеолин)

Отечественные исследования в области фундаментальной и клинической онкологии и В23 (нуклеофозмин). Эти белки участвуют в синтезе рРНК и выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5–3 раза в S- и G2-фазы [11]. Показана обратная зависимость между Ag-ЯОР-белками и длительностью клеточного цикла [4], временем удвоения аденокарциномы легкого [8].

Munakata S. и Hendricks J. B. предложили метод двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-бел-ки, позволяющий оценивать активность ядрышковых организаторов (продолжительность клеточного цикла) в пролиферирующих клетках [7]. В мировой литературе работы посвященные исследованию пролиферативного потенциала опухоли с использованием двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки немногочисленны [1–3, 5, 6, 13, 15]. Отсутствуют работы, в которых результаты двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки оцениваются с использованием компьютерного анализа изображений и во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого.

Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого.

Материал и методы. Исследованы 94 операционных материалов аденокарциномы легкого, удаленных за период 2007–2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет), 68 мужчин (72%) и 26 женщин (28%). Выполнена лобэктомия 76 пациентам (81%) и пневмонэктомия 18 пациентам (19%). Предоперационная химиотерапия и лучевая терапия не проводились. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7 пересмотра [12]. Количество опухолей с Т 1–31 случай (33%), с Т 2–50 случаев (53%), с Т 3–13 случаев (14%); с наибольшим размером опухоли менее 3 см – 43 случая (46%), более 3 см – 51 случай (54%); с N0–60 случаев (64%), с N1–3 – 34 случая (36%); с I стадией – 51 случай (54%), со II стадией – 24 случая (26%), с III стадией – 19 случаев (20%); с высокой дифференцировкой – 14 случаев (15%), с умереной дифференцировкой – 46 случаев (49%), с низкой дифференцировкой – 34 случая (36%).

Из парафиновых блоков забраны столбики ткани иг-лой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм, на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Для исключения гетерогенности окрашивания изготовлена тканевая матрица, с которой приготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм. Тканевая матрица окрашена иммуногистохимическим методом, согласно протоколу производителя: стрептавидин-биотиновым методом с первичными антителами к Ki-67 (клон MIB-1, DAKO) и хромогеном – new fuchsin. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120°С 20 минут, в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0). После инкубации с хромогеном срезы отмывали в бидистилированной воде. Далее срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [7, 14]: во влажной камере при 37°С 19 минут. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в водную среду Faramount (DAKO). В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100 случайно выбранных MIB-1 позитивных клеток с 10–30 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении х1000 (объектив х100, 1.25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм2 исключены из анализа.

Статистический анализ данных осуществляли в программе STATISTICA 6.0. Так как полученные данные в выборках соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W=0,98, р>0,05), то меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), а меру рассеяния в виде стандартного отклонения (SD). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела-Уоллиса, U-тест Манна-Уитни, коэффициент корреляции рангов Спирмена. Определяли общую скорректированную выживаемость больных за пятилетний период после операции, использовали метод Каплана-Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р<0,05.

Результаты. В аденокарциноме легкого площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках составила 10,56±2,96 мкм 2 . Отмечалось последовательное увеличение площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в группах Т 1, Т 2 и Т 3 - соответственно 9,08±2,21 мкм 2 , 11,05±3,11 мкм 2 и 12,32±2,49 мкм 2 ; однако, статистически значимое отличие найдено только между группами Т 1 и Т 2 (р=0,003), Т 1 и Т 3 (р<0,001). При размере первичной опухоли менее 3 см площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках была меньше, чем в опухоли более 3 см (р<0,001) - соответственно 9,17±2,55 мкм 2 и 11,76±2,77 мкм 2 . Найдено статистически значимое увеличение площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в аденокарциноме легкого с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (р<0,001) – соответственно 9,76±2,60 мкм 2 и 12,03±3,03 мкм 2 . Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках достоверно меньше при 1 стадии по сравнению со 2 стадией (р=0,005) и 3 стадией (р=0,01) - соответственно 9,63±2,45 мкм 2 , 11,77±3,19 мкм 2 и 11,62±3,14 мкм 2 . Также площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках достоверно меньше при высокодифференцированной аденокарциноме по сравнению с умерено дифференцированной (р<0,001) и низко дифференцированной (р=0,003) – соответственно 8,25±1,99 мкм 2 , 11,28±3,02 мкм 2 и 10,59±2,77 мкм 2 . В аденокарциноме легкого площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,40, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,46, р<0,001), показателем N (r=0,35, р<0,001), стадией процесса (r=0,33, р=0,001) и дифференцировкой (r=0,36, р<0,001).

Случаи с площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 10,56 мкм 2 и более считались с большой площадью (44 случая -47%), до 10,56 мкм 2 - с небольшой (50 случаев – 53%). Общая скорректированная выживаемость больных аденокарциномой легкого за пятилетний период после операции составила 29,8±5,6%. Выживаемость больных аденокарциномой легкого имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках: 45,0±8,9% – при небольшой площади и 7,9±4,8% – при

Взаимосвязь клинико-морфологических параметров и выживаемости при аденокарциноме легкого с активностью ядрышковых организаторов в mib-1 позитивных клетках большой. При однофакторном регрессионном анализе площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках аденокарциномы легкого имела влияние на выживаемость больных (χ2=25,5, β=1,43, стандартная ошибка 0,29, р<0,001). При проведении многофакторного регрессионного анализа (χ2=49,9) влияние на выживаемость больных имели площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (β=0,95, стандартная ошибка 0,33, р=0,004), стадия процесса (β=1,00, стандартная ошибка 0,46, р=0,03) и наибольший размер опухоли (β=0,96, стандартная ошибка 0,40, р=0,02).

Обсуждение. В нашем исследовании аденокарциномы легкого найдена взаимосвязь площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM, однако, достоверные отличия получены только при начальных этапах развития: Т 1, наибольшем размере опухоли менее 3 см, N0, I стадии и высокой дифференцировке. В других исследованиях также показана взаимосвязь отдельных клинико-морфологических параметров по системе TNM с Ag-ЯОР-белка-ми в MIB-1 позитивных клетках. Yamaguchi S. при немелкоклеточном раке легкого нашел увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Т 4 по сравнению с Т 1–3 и при N 2, 3 по сравнению с N 0, 1 [15]. Kidogawa H. с соавторами при раке молочной железы нашли увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в опухоли с наибольшим размером более 2 см по сравнению с опухолью менее 2 см [5]. Tomobe M. с соавторами при раке мочевого пузыря нашли последовательное увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в группах Т 1, Т 2, Т 3 и достоверное отличие только для Т 1 [13]. Однако, результаты в этих работах получены при субъективном анализе (визуальном подсчете количества Ag-ЯОР-белков) в отличие от наших результатов, полученных при объективном анализе (компьютерном программном анализе изображений).

Выживаемость больных аденокарциномой легкого с небольшой площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках лучше по сравнению с большой. При проведении одно- и многофакторного регрессионного анализа площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках имела независимое влияние на выживаемость больных аденокарциномой легкого. Результаты аналогичные нашим получены при исследовании немелкоклеточного рака легкого [3], рака молочной железы [1, 2, 5, 6] и мочевого пузыря [13]. Многочисленные исследования активности ядрышковых организаторов в злокачественных опухолях указывают, что содержание Ag-ЯОР-белков – независимый фактор прогноза [9]. Прогностическая значимость содержания Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с разными темпами пролиферации аденокарциномы легкого: при большой площади Ag-ЯОР-бел-ков в MIB-1 позитивных клетках – короткий клеточный цикл пролиферирующих клеток и высокая скорость пролиферации, и наоборот, при небольшой площади – длинный клеточный цикл пролиферирующих клеток и низкая скорость пролиферации.

Таким образом, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM и выживаемостью при аденокарциноме легкого.

Выводы:

• 1.    В аденокарциноме легкого площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания и дифференцировкой.

• 2.    Выживаемость больных аденокарциномой легкого с небольшой площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках лучше по сравнению с большой.

• 3.    Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках – независимый фактор прогноза при аденокарциноме легкого.