Взаимосвязь маркеров апоптоза (р53, bcl2, bax) с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого

Рак легкого (РЛ) занимает ведущее место в заболеваемости и смертности среди злокачественных новообразований. Не менее 80 % случаев РЛ приходится на немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ), отдаленные результаты лечения которого остаются неудовлетворительными. В связи с этим ведется поиск предиктивных и прогностических морфологических параметров НМКРЛ.

Развитие апоптоза происходит в результате последовательной активации каспаз (сериновых протеаз). Апоптоз запускается двумя путями: рецепторным (через активацию каспаз 8 и 10) и митохондриальным путем (через активацию каспазы 9). Оба пути на конечном этапе активируют эффекторные каспазы 3, 6 и 7. Bcl-2 является антиапоптотическим белком, а bax – проапоптоти-ческим белком митохондриального пути активации апоптоза, которая происходит через белок р53, а инактивация – через димеризацию с белком bcl-2. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов, выполняя супрессорную функцию (остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз). Белки семейства bcl-2 (около 20 белков) расположены на наружной митохондриальной мембране, способны к димеризации – от вида димеризации (анти- и проапоптотических белков) и их баланса зависят проницаемость митохондриальной мембраны и вступление клетки в апоптоз. Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи маркеров апоптоза (p53, bax и bcl-2) с клинико-морфологическими параметрами, выживаемостью больных и прогнозом НМКРЛ [12, 17, 21]. Кроме того, взаимосвязи коэкспрессии p53, bax и bcl-2 с выживаемостью больных при НМКРЛ посвящены единичные исследования.

Целью работы явилось исследование экспрессии р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами и показателями 5-летней выживаемости при НМКРЛ.

Материал и методы

Исследованы 237 образцов операционного материала НМКРЛ, полученных за период с 2007 по 2009 г. в Алтайском краевом онкологическом диспансере, случаи РЛ с отдаленными метастазами и множественными опухолями исключены из исследования. Средний возраст пациентов составил 59 лет (35–75 лет), мужчин было 203 (86 %), женщин – 34 (14 %). Лобэктомия выполнена 166 (70 %), пневмонэктомия – 71 (30 %) пациенту. Все больные получали хирургическое лечение без дополнительной химиотерапии. Патогисто-логическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [18] (табл. 1).

Фрагменты опухолевой ткани фиксировали 18–24 ч в 10 % нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного

Экспрессия p53, bcl-2 и bax при нМКрЛ

Таблица 1

Характеристика	Кол-во случаев	+p53	+bcl-2	+bax
Первичная опухоль
Т 1	63 (27 %)	25 (40 %)	14 (22 %)	32 (51 %)
Т2–3	174 (73 %)	79 (45 %)	29 (17 %)	98 (56 %)
Наибольший размер
<3 см	98 (41 %)	36 (37 %)	21 (21 %)	50 (51 %)
≥3 см	139 (59 %)	68 (49 %)	22 (16 %)	80 (56 %)
Лимфатические узлы
N 0	150 (63 %)	62 (41 %)	34 (23 %)	85 (57 %)
N1–3	87 (37 %)	42 (48 %)	9 (10 %)	45 (52 %)
Стадия
I	120 (51 %)	51 (43 %)	30 (25 %)	68 (57 %)
II–III	117 (49 %)	53 (45 %)	13 (11 %)	62 (53 %)
Гистогенез
Аденокарцинома	109 (46 %)	39 (36 %)	13 (12 %)	69 (63 %)
Плоскоклеточный рак	128 (54 %)	65 (51 %)	30 (23 %)	61 (48 %)
Дифференцировка
Высокая	58 (25 %)	23 (40 %)	15 (26 %)	33 (57 %)
Умеренная/низкая	179 (75 %)	81 (45 %)	28 (16 %)	97 (54 %)

Иммуногистохимическим методом определяли р53 (клон DO-7, Dako), bcl-2 (клон 124, Dako) и bax (клон SP47, SpringBio) в автоматическом стейнере Ventana XT, система визуализации ultraView. В каждом случае исследовали 1000 клеток в 5–7 полях зрения, при увеличении ×400. Определяли индекс метки – количество положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток в процентах (для р53 ядерное окрашивание, для bcl2 и bax – цитоплазматическое). Индекс метки р53, bcl2, bax более 10 % считался положительной экспрессией (+) антигена в опухоли, менее 10 % – отрицательной экспрессией (–) [4, 8, 10, 16]. Результат иммуногистохимической окраски определялся в виде окрашивания (от светло- до темно-коричневого оттенка) ядер (для р53) или цитоплазмы (для bcl-2 и bax) клеток.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе STATISTICA 6.0. При проверке статистических гипотез применяли двусторонний точный критерий Фишера для таблиц 2×2, коэффициент корреляции рангов Спирмена. Определяли общую скорректированную выживаемость больных за пятилетний период после операции, использовали метод Каплана–Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р<0,05.

Результаты исследования

При анализе уровня экспрессии р53, bcl-2 и bax в эпителиальных клетках НМКРЛ в зависимости от морфологических параметров опухоли корреляции между этими показателями не обнаружено (р<0,3) (см. табл. 1). Выявлено статистически значимое увеличение количества случаев с +р53 при плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой (р<0,05). Отмечается значимое увеличение +bcl-2 в группе опухолей без поражения лимфатических узлов по сравнению с опухолями с наличием лимфогенных метастазов (р<0,05), при НМКРЛ I стадии по сравнению с НМКРЛ II–III стадий (р<0,01), а также при плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой (р<0,05). Количество случаев с +bax значимо выше при аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком (р<0,05). При НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с р53 (r=0,15, р<0,05), bcl-2 (r=0,15, р<0,05) и bax (r=0,16, р<0,01), показатель N и стадия процесса – с bcl-2 (r=0,15, р<0,05 и r=0,18, р<0,01). Таким образом, гистогенез НМКРЛ взаимосвязан с экспрессией р53, bcl-2 (выше в плоскоклеточном раке) и bax (выше в аденокарциноме), что, вероятно, отражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли. При появлении лимфогенных метастазов и при более поздних стадиях заболевания экспрессия белка bcl-2 снижается, что указывает и на снижение антиапоптотического влияния этого белка.

Общая 5-летняя скорректированная выживаемость больных НМКРЛ, получивших оперативное лечение, составила 40,4 ± 3,5 %. Показатели выживаемости больных НМКРЛ имели статистически значимые отличия в зависимости от экспрессии р53 (р=0,03) и bcl-2 (р=0,004) (табл. 2). Отдаленная выживаемость при +bax имела тенденцию к снижению, однако отличия не значимы. При анализе взаимосвязи уровня отдаленных результатов лечения больных НМКРЛ и коэкспрессии антигенов выявлено, что показатели 5-летней выживаемости уменьшались в ряду иммунофенотипов опухоли: 1) –p53/+bcl-2, –p53/–bcl-2, +p53/+bcl-2 и +p53/–bcl-2; 2) –p53/–bax, –p53/+bax, +p53/–bax и +p53/+bax; 3) +bcl-2/–bax, +bcl-2/+bax, –bcl-2/–bax и –bcl-2/+bax (рис. 1). При анализе парной коэкспрессии р53 и bcl-2 статистически значимые отличия показателей выживаемости больных получены только для иммунофенотипа –p53/+bcl-2 (р<0,001). При анализе парной коэк-спрессии р53 и bax больные с иммунофенотипом +p53/+bax имели наихудшие 5-летние показатели,

Рис. 1. Графики выживаемости больных НМКРЛ по Каплану–Мейеру: а – при иммунофенотипе p53/bcl-2; б – при иммунофенотипе p53/bax;

в – при иммунофенотипе bcl-2/bax. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 5

отличия значимы, по сравнению с иммунофенотипами –p53/–bax и –p53/+bax (р<0,05). При анализе парной коэкспрессии bcl-2 и bax отмечается тенденция к снижению выживаемости при +bax в опухолях с +bcl-2 или –bcl-2 иммунофенотипом. Таким образом, показатели выживаемости больных НМКРЛ выше при +bcl-2 опухолях, хуже – при +p53 опухолях и имеют тенденцию к снижению при +bax опухолях. В связи с этим были проанализированы отдаленные результаты лечения больных НМКРЛ при тройной экспрессии антигенов. Наилучший показатель выживаемости (60,4 ± 22,6 %) наблюдался при иммунофенотипе p53/+bcl-2/–bax, который был выявлен у 8 (3 %) больных НМКРЛ. Наихудший показатель выживаемости (23,9 ± 7,1 %) отмечен при иммунофенотипе +p53/–bcl-2/+bax, который диагностирован у 45 (19 %) больных НМКРЛ. Однако при сравнении уровня выживаемости с тройной экспрессией антигенов p53, bcl-2 и bax статистически значимые отличия не получены. Таким образом, показатели выживаемости больных НМКРЛ взаимосвязаны как с экспрессией отдельных антигенов p53, bcl-2 и bax, так и с их коэкспрессией.

При проведении однофакторного регрессионного анализа с выживаемостью больных НМКРЛ были связаны экспрессия р53 (χ2=4,6, β=0,38, стандартная ошибка – 0,18, р=0,03) и экспрессия bcl-2 (χ2=8,5, β=0,75, стандартная ошибка – 0,28, р=0,008). Показатель N (отсутствие или наличие

Таблица 2

Показатели 5-летней общей скорректированной выживаемости у больных нМКрЛ в зависимости от экспрессии p53, bcl-2, bax

Характеристика	Кол-во случаев	Показатели 5-летней выживаемости
p53
–p53	133 (56 %)	46,2 ± 4,7 %
+p53	104 (44 %)	32,4 ± 5,1 %
bcl-2
–bcl-2	194 (82 %)	35,6 ± 3,8 %
+bcl-2	43 (18 %)	58,4 ± 8,8 %
bax
–bax	107 (45 %)	44,8 ± 5,2 %
+bax	130 (55 %)	36,8 ± 4,7 %
p53 и bcl-2
–p53/+bcl-2	23 (10 %)	70,1 ± 12,5 %
–p53/–bcl-2	110 (46 %)	38,9 ± 5,1 %
+p53/+bcl-2	20 (8 %)	32,6 ± 12,7 %
+p53/–bcl-2	84 (36 %)	30,3 ± 5,6 %
p53 и bax
–p53/–bax	56 (24 %)	47,4 ± 7,3 %
–p53/+bax	77 (32 %)	43,5 ± 6,4 %
+p53/–bax	51 (22 %)	38,8 ± 7,5 %
+p53/+bax	53 (22 %)	25,3 ± 6,8 %
bcl-2 и bax
+bcl-2/–bax	20 (8 %)	58,9 ± 13,3 %
+bcl-2/+bax	23 (10 %)	56,2 ± 10,8 %
–bcl-2/–bax	87 (37 %)	39,5 ± 5,7 %
–bcl-2/+bax	107 (45 %)	32,4 ± 5,1 %

метастазов в лимфатические узлы), размер опухоли (до 3 см или более), дифференцировка (высокая или умеренная/низкая) имели независимую взаимосвязь с выживаемостью больных НМКРЛ при многофакторном регрессионном анализе (χ2=95,5, р<0,001). Таким образом, однофакторный анализ показал, что р53 и bcl-2 являются значимыми прогностическими факторами, однако в совокупности с клинико-морфологическими данными по системе TNM маркеры апоптоза не взаимосвязаны с прогнозом НМКРЛ.

Обсуждение

По нашим данным не найдена корреляция между маркерами апоптоза р53, bcl-2 и bax, что согласуется с результатами других исследований [1, 6, 8, 16] и указывает на их независимую экспрессию в НМКРЛ. Однако в некоторых исследованиях показана обратная корреляция между р53 и bcl-2 при НМКРЛ [3, 10]. В клеточных структурах НМКРЛ содержание р53, bcl-2 и bax взаимосвязано с гистогенетическим происхождением опухоли: экспрессия р53 и bcl-2 выше при плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой, экспрессия bax выше при аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком. Полученные результаты подтверждаются данными мировой литературы [1, 9, 10, 14, 15]. В нашем исследовании выявлена высокая экспрессия белка bcl-2 в опухолях без лимфогенных метастазов и при НМКРЛ I стадии. Аналогичные результаты получены рядом зарубежных исследователей [3, 6], однако в сообщении Y. Shibata et al. представлены противоположные данные [16].

Выживаемость больных НМКРЛ с +р53 достоверно ниже по сравнению с –р53. Наши результаты совпадают с литературными данными [2, 7, 8, 13, 17, 21]. Однако в других исследованиях не установлена взаимосвязь экспрессии р53 с выживаемостью больных НМКРЛ [3, 5, 10, 14, 16, 19] или получены противоположные результаты [11]. Снижение выживаемости больных НМКРЛ при +р53 объясняется высокой корреляцией (более 70 %) иммуногистохимически выявляемого мутантного белка р53 и наличием точечных мутаций в гене р53 [19]. При возникновении мутаций в гене р53 изменяется не только функция белка р53 в отношении апоптоза, но и удлиняется время распада белка р53, в результате чего становится возможным его определение методом иммуногистохимии.

В проведенном исследовании выявлено, что показатели выживаемости больных НМКРЛ с +bcl-2 достоверно выше по сравнению с –bcl-2, что совпадает с данными мировой литературы [1–3, 8, 12–14]. Тем не менее в некоторых публикациях не показано взаимосвязи экспрессии bcl-2 с уровнем выживаемости больных НМКРЛ [5, 7, 10, 16, 20] или представлены противоположные результаты [6, 15]. Данный факт труднообъясним, поскольку bcl-2 – это антиапоптотический белок, однако инициация митохондриального апоптоза зависит не только от экспрессии bcl-2, но и от совокупного влияния всех белков семейства bcl-2. Кроме того, при +bcl-2 отмечаются снижение пролиферативной активности [8] и увеличение площади некрозов в опухоли [2].

Выживаемость больных НМКРЛ не связана с экспрессией bax, что совпадает с большинством литературных данных [1, 2, 6, 20]. Взаимосвязь увеличения выживаемости больных с высокой экспрессией bax выявлена в единичных исследованиях – при распространенном НМКРЛ [4] и при аденокарциноме легкого [9]. Вероятно, влияние на выживаемость экспрессии bax взаимосвязано с суммарным влиянием других белков семейства bcl-2.

Нами установлено, что на выживаемость больных НМКРЛ влияет также коэкспрессия р53, bcl-2 и bax. В частности, при иммунофенотипе –p53/+bcl-2 выживаемость НМКРЛ наилучшая. Аналогичные результаты получены Y. Ohsaki et al. [14], H. Ishida et al. [8] и R.M. Apolinario et al. [1], которые показали, что при иммунофенотипе +p53/–bcl-2 показатели выживаемости при НМКРЛ наихудшие, однако в нашем исследовании не получено значимых отличий. Кроме того, R.M. Apolinario et al. [1] сообщают, что при иммунофенотипе +bax/–bcl2 выживаемость наихудшая, что также согласуется с нашими данными (в нашем исследовании отличия не значимы). Противоположные данные опубликованы R.S. Lai et al. [10], которые не выявили различий в выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с коэкспрессией р53, bcl-2 и bax. Таким образом, для получения более точных актуариальных кривых выживания больных НМКРЛ необходимо учитывать взаимную коэкспрессию маркеров апоптоза р53, bcl-2 и bax.

При однофакторном регрессионном анализе выявлено, что р53 и bcl-2 являются прогностическими факторами при НМКРЛ. Однако при многофакторном регрессионном анализе молекулярно-биологические данные об экспрессии маркеров апоптоза р53, bcl-2 и bax не были взаимосвязаны с прогнозом НМКРЛ в совокупности с клинико-морфологическими данными по системе TNM. Данные метаанализов также подтверждают ограниченную прогностическую значимость экспрессии р53 и bcl-2 [12, 17, 21].

Заключение

В проведенном исследовании установлено, что маркеры апоптоза р53, bcl-2 и bax взаимосвязаны с клинико-морфологическими параметрами и уровнем выживаемости больных при немелкоклеточном раке легкого. Экспрессия bcl-2 и р53 выше при плоскоклеточном раке, экспрессия bax выше при аденокарциноме, экспрессия bcl-2 выше при отсутствии лимфогенных метастазов и при раке легкого I стадии. Показатели выживаемости больных НМКРЛ взаимосвязаны с экспрессией p53, bcl-2 и не зависят от экспрессии bax, они выше при экспрессии bcl-2 и ниже при экспрессии p53. Уровень выживаемости больных НМКРЛ связан с взаимным содержанием bcl-2, р53 и bax. Он возрастает при иммунофенотипах –p53/+bcl-2 и –p53/+bcl-2/–bax и снижается при иммунофенотипах +p53/+bax и +p53/–bcl-2/+bax. При однофакторном регрессионном анализе bcl-2 и р53 являлись факторами прогноза. Многофакторный регрессионный анализ не выявил взаимосвязи bcl-2, р53 и bax с прогнозом НМКРЛ.