Взаимосвязь нарушений углеводного обмена и маркеров дисфункции эндотелия у животных с абсолютной недостаточностью инсулина при биостимуляции аутотрансплантацией кожного лоскута

• ¹ В ведение. Распространенность среди взрослого населения такого заболевания, как СД, — актуальная медико-социальная проблема. Основной причиной ранней инвалидизации и смертности при СД являются сосудистые нарушения (микро- и макроангиопатии). Перед эндокринологами и специалистами других профилей стоит задача изучения механизма развития данных нарушений при СД и разработки новых методов их коррекции [1, 2]. В последние годы в патогенезе СД и его сосудистых осложнений обсуждается роль нарушения ангиогенеза. В физиологических условиях процесс ангиогенеза контролируется балансом про-и антиангиогенных факторов [1]. Ключевым стимулятором ангиогенеза является VEGF [1, 3].

Хроническая гипергликемия, окислительный стресс, гипоксия, конечные продукты гликолиза, воспаление при СД приводят к нарушению процесса ангиогенеза за счет усиления синтеза VEGF, основного проангиогенного фактора, что способствует прогрессии микрососудистых осложнений, вызывая нестабильность новообразованных сосудов [1, 2, 4]. В связи с этим очевидна актуальность совершенствования методов коррекции метаболических нарушений, лежащих в основе развития одного из осложнений СД — ангиопатии.

Цель: изучить взаимосвязь нарушений углеводного обмена и маркеров дисфункции эндотелия у жи-

вотных с абсолютной недостаточностью инсулина при биостимуляции аутотрансплантацией кожного лоскута.

Материал и методы . Опыты проведены на 60 самцах белых беспородных крыс массой 200–250 г, разделенных на следующие группы: контрольную, в которую вошли 20 крыс; две группы сравнения по 10 животных с аллоксановым СД; опытную группу, состоящую из 20 животных с аллоксановым СД, которым проведена АТПКЛ. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.

СД у крыс вызывали подкожным введением 5%-го раствора аллоксана в 9%-м растворе NaCl из расчета 100 мг на 1 кг веса животного [5].

Животным, которым проводили АТПКЛ для достижения наркоза за 10 минут до проведения манипуляции внутримышечно вводили телазол (Zoetis Inc, Испания) из расчета 0,1 мл/кг и ксиланит (ООО «Нита-Фарм», Россия) в дозе 1 мг/кг веса животного. АТПКЛ осуществлялась в межлопаточную область. Полнослойный кожный лоскут размером 0,1% от площади поверхности тела животного иссекали на депилированном участке кожи в асептических условиях. Для удаления разрушенных клеток и дезинфекции кожный лоскут обрабатывали в 3%-м растворе перекиси водорода, 70%-м этиловом спирте и физиологическом растворе. Обработанный таким образом

Контроль           СД (42 сут.)                          □ 25%-75%

СД (21 сут.)          СД+АТПКЛ                I 1%-99%

Рис. 1. Изменение уровня гликированного гемоглобина при немедикаментозной коррекции сахарного диабета

контроль          СД42сут,                        П25%-75%

СД21 сут.          СД+АТПКЛ              I 1%-99%

Рис. 2. Изменение уровня глюкозы при немедикаментозной коррекции сахарного диабета

лоскут помещали в карман, сформированный в ране между кожей и собственной фасцией. Для фиксации лоскута в сформированном канале рану ушивали послойно наглухо [6].

Для диагностики СД в цельной крови определяли HbA1c с использованием реактивов фирмы DiaSys (Германия) на анализаторе Sapphire 400 (Hirose Electronic System, Япония). Проявление субклинического хронического воспаления оценивали по содержанию в сыворотке крови СРБ, который определяли методом турбо-диметрии с использованием наборов реактивов фирмы DiaSys Diagnostic Systems GmbH (Германия), на анализаторе Sapphire-400 (Япония). Ангиогенез оценивали по содержанию в сыворотке крови VEGF, определяемого методом твердофазного ИФА с использованием наборов «VEGF Rat» фирмы RnD Systems (США), измерение оптической плотности проводили на автоматическом микропланшетном спектрофотометре EpochBioTek Instruments, (Bio-Tek Instruments, Inc., США).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 10 (StatSoft, США). Данные представлены в формате медианы и квартильного диапазона. Для сравнения полученных показателей использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при p<0,05.

Результаты. Развитие аллоксанового диабета у крыс сопровождалось активацией начальных реакций неферментативного гликозилирования. Через 21 сутки после введения аллоксана у животных первой сравнительной группы верифицировали СД путем определения в цельной крови HbA1c (рис. 1).

На 42-е сутки у животных сохранялся аллоксановый диабет, о чем свидетельствовало повышенное, по сравнению с контрольной группой, содержание HbA1c. Значимых различий между уровнем HbA1c у крыс первой и второй сравнительных групп не выявлено, что свидетельствовало о стойком нарушении углеводного обмена. У животных опытной группы под влиянием АТПКЛ к 42-м суткам происходило снижение уровня HbA1c, его концентрация приближалась к значениям, наблюдаемым в контрольной группе, и имела статистически значимые различия со значениями в группе сравнения. Еще одним признаком СД является уровень глюкозы в крови (базальная гликемия). Так, уровень содержания глюкозы в сыворотке крови животных с СД повышался на 21-е сутки эксперимента и оставался высоким до 42-х суток, однако различия и в первом, и во втором случае с контрольной группой были статистически не значимы. После АТПКЛ к 42-м суткам уровень глюкозы имел тенденцию к снижению до нормальных значений, но не имел статистически значимых различий ни с контрольной группой, ни с группой сравнения (рис. 2).

При оценке изменений концентрации СРБ в сыворотке крови животных группы сравнения выявлено повышение его уровня на 42-е сутки относительно контрольной группы. АТПКЛ вызывала снижение уровня СРБ к 42-м суткам эксперимента, однако его концентрация оставалась высокой по сравнению с группой контроля (таблица).

Установлено, что при аллоксановом СД уровень VEGF в сыворотке крови значимо увеличивался на 42-е сутки. У животных опытной группы также наблюдалось

Изменение показателей воспаления и ангиогенеза при немедикаментозной коррекции экспериментального сахарного диабета

Показатель	Группа
	Контроль	Группа сравнения (аллоксановый СД)	Опытная группа (СД + АТПКЛ)
VEGF	9,4 (7,3; 15,7)	85,2 (79,6; 97,5) p1<0,001	83,3 (78,9; 86,3) p =0,001 p12=0,286
СРБ	18,6 (18,5; 19,3)	20,6 (19,9; 22,0) p <0,001	19,3 (19,3; 20,4) p =0,025 p1=0,043

Примечание: р1 — значимость различий по сравнению с контролем; р2— значимость различий по сравнению с группой сравнения повышение концентрации VEFG и отсутствие значимых различий с группой сравнения (см. таблицу).

Обсуждение. Аллоксан по химической природе является нестабильным пиримидином (2,4,5,6-тетра-оксогексагидропиримидин) и обладает выраженным диабетогенным действием. При введении в организм он связывается с мембранными рецепторами β-клеток поджелудочной железы и вызывает снижение секреции инсулина. В механизме возникновения и развития аллоксанового диабета отсутствует аутоиммунная составляющая, тем не менее токсическое действие аллоксана индуцирует процессы, происходящие при аутоиммунном повреждении β-клеток поджелудочной железы в условиях СД 1-го типа, а именно: свободнорадикальное повреждение, гликозилирование белков, возникновение апоптоза. Через несколько минут после введения в организм наблюдается токсический эффект аллоксана, а инсулиновая недостаточность начинает проявляться через несколько суток [5].

Известно, что измерение глюкозы в крови позволяет оценить ее уровень в конкретный момент, который зависит от многих факторов, в том числе от приема пищи и ее состава, физической активности и др. [5]. В связи с этим становится понятной высокая вариабельность концентрации глюкозы в организме, поэтому определение ее текущего уровня в крови не отражает степень выраженности и компенсации СД. Ценность определения HbA1c состоит в том, что он характеризует среднее содержание глюкозы в крови на протяжении длительного промежутка времени, в связи с этим HbA1с используют в качестве показателя компенсации СД, поскольку существует четкая взаимосвязь между HbA1с и уровнем гликемии [5]. Кроме того, HbA1с рассматривается как достоверный предиктор микро- и макрососудистых осложнений диабета [4, 5]. Следовательно, уменьшение содержания HbA1с при АТПКЛ свидетельствует о компенсации СД и снижении риска развития микро-циркуляторных нарушений.

Подтверждением того, что одним из патогенетических звеньев СД является воспаление, служит достоверное повышение в сыворотке крови животных с аллоксановым диабетом содержания белка острой фазы — СРБ по сравнению с показателем в группе контроля. Рядом авторов показано, что метаболические нарушения, обусловленные хронической гипергликемией, ишемией и субклиническим воспалением при СД, приводят к повышенной экспрессии VEGF [2, 7, 9, 10]. Увеличение продукции последнего способствует прогрессии микрососудистых осложнений за счет нестабильности вновь образованных сосудов. Под действием АТПКЛ уровень СРБ в сыворотке крови крыс достоверно снизился относительно аналогичного показателя в группе сравнения.

Значит, АТПКЛ у крыс с СД вызывает уменьшение содержания HbA1с, СРБ и стабилизацию экспрессии VEGF, следствием чего является снижение риска развития микроциркуляторных нарушений.

Заключение. Результаты проведенного исследования позволяют сделать следующее заключение: АТПКЛ оказывает положительный эффект на уровень гликемии при экспериментальном СД у крыс, а также приводит к снижению субклинического воспаления, вызванного хронической гипергликемией, и, как следствие, к снижению риска развития микро-циркуляторных нарушений.