Взаимосвязь NKT-клеток и активированных CD25+ лимфоцитов периферической крови с продолжительностью безрецидивной и общей выживаемости больных трижды негативным раком молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) характеризуется клеточной и молекулярной гетерогенностью и является наиболее распространенным злокачественным новообразованием среди женщин во всем мире. В клинике для прогноза РМЖ используют различные клинико-патологические, молекулярные и генетические факторы, тем не менее исход этого заболевания во многих случаях трудно предсказать. Установление надежных прогностических факторов при РМЖ имеет решающее значение для разработки методов эффективной индивидуальной помощи пациенткам [1]. Важную роль в контроле над возникновением и ростом злокачественных новообразований играет иммунная система [2, 3]. Появляется все больше свидетельств того, что взаимодействие между иммунными и опухолевыми клетками оказывает значимое влияние на развитие и прогрессирование рака молочной железы [4]. Опухоль индуцирует как локальный, так и системный иммунный ответ, и иммунные клетки, как инфильтрирующие опухоль, так и лимфоциты периферической крови (ПК), могут иметь прогностическое значение [5–7]. Иммун- ная система пациента активно взаимодействует с различными видами противоопухолевой терапии [8, 9]. Ключевыми эффекторными клетками противоопухолевого иммунитета являются CD8+ T-лимфоциты, положительное прогностическое значение которых продемонстрировано в различных клинических исследованиях [10]. В то же время в ответе на опухоль участвует значительное число лимфоцитарных популяций как адаптивного, так и врожденного иммунитета, которые также могут иметь прогностическое значение. Ранее при изучении субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных с трижды негативным (ТН) РМЖ мы обнаружили, что снижение количества NKT-клеток и активированных CD25+ лимфоцитов до начала неоадъювантной химиотерапии ассоциировалось с повышением вероятности прогрессирования заболевания [11]. В данной работе проводилось дальнейшее изучение возможной прогностической значимости этих популяций лимфоцитов у пациенток c ТН РМЖ.

Проведенное в настоящей работе определение взаимосвязи исходного количества NKT-клеток и CD25+лимфоцитов ПК с выживаемостью больных ТН РМЖ, получавших стандартную противоопухолевую терапию, является актуальным и может послужить основой для установления прогностической значимости этих популяций лимфоцитов, а также более точного предсказания исхода заболевания.

Цель исследования – изучить взаимосвязь исходного количества NKT- и CD25⁺ лимфоцитов ПК с продолжительностью безрецидивной (БРВ) и общей выживаемости (ОВ) больных ТН РМЖ, получивших неоадъювантную химиотерапию цисплатином и паклитакселом с последующей операцией.

Материал и методы

В исследование было включено 50 больных ТН РМЖ II и III стадии. Медиана возраста составила 50 лет (от 26 до 76 лет). После 4–6 курсов химиотерапии (паклитаксел 80 мг/м2, в 1, 8, 15-й дни + цисплатин 75 мг/м2, в 1-й день, цикл 28 дней) все пациентки подвергались хирургическому лечению. Период наблюдения составил 36 и 66,9 мес. Данные о прогрессировании заболевания и выживаемости в течение 3-летнего периода были получены относительно 50 (у 24 из них отмечалось прогрессирование заболевания) и 42 (13 из них умерли) пациенток соответственно.

Иммунологическое обследование пациенток (многопараметровый цитометрический анализ на пятипараметровом проточном цитофлуориметре аналитического типа FACSCalibur «BectonDickinson», CШA) проводилось непосредственно перед началом химиотерапии. Лимфоциты выделялись по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Для двух-, трех- и четырех- цветного окрашивания клеток использовали моноклональные антитела, конъюгированные с FITC, PE, PC5 (Bekman Coulter США; «Сорбент», Россия), к следующим маркерам лимфоцитов: CD45, CD3, CD16, CD56, CD25. В группу сравнения (К) вошли практически здоровые женщины соответствующего возраста (n=26). Все пациентки дали информированное согласие на проведение иммунологического обследования.

Для статистического анализа данных использовали пакет статистических программ «Статистика 7». Результаты представлены в виде Ме (Медиана) и 95 % доверительного интервала Me (95 % ДИ). Анализ выживания проводили с помощью метода Каплана–Майера. Для сравнения кривых выживания использовали лог-ранговый критерий (log-rank test) или критерий Кокса–Мантеля (Cox– Mantel test) и F-критерий Кокса (Cox’s F-Test). В качестве точки отсчета для определения уровня каждого иммунологического показателя принимали значение его медианы в контрольной группе Mecontr (N). Уровень статистической значимости был принят равным 0,05.

Результаты

Исследовалось значение исходного количества CD3+CD16+CD56+ NKT-клеток для трехлетней БРВ (n=50) и ОВ (n=42) больных ТН РМЖ, получавших неоадъювантную химиотерапию (паклитаксел + цисплатин) и последующее оперативное лечение. У пациенток, у которых количество NKT-клеток до лечения было ниже контрольного значения, БРВ была статистически значимо уменьшена по сравнению с пациентками, у которых процент этих клеток был выше, чем Mecontr (8,7 %). При этом БРВ у больных с количеством NKT-клеток

Рис. 1. Взаимосвязь трехлетней без-рецидивной (a) и общей (b) выживаемости больных ТН РМЖ с количеством CD3+CD16+CD56+ (NKT%) лимфоцитов до начала химиотерапии (по методу Каплана–Мейера).

Примечание: о– нецензурированные данные: (a) n=24, (b) n=13;

⁺– цензурированные данные (больные с безрецидивным течением заболевания или живые пациентки на момент анализа): (a) n=26, (b) n=29

Fig. 1. The relationship between the three-year relapse-free (a) overall (b) survival of breast cancer patients and the number of CD3+CD16+CD56+(NKT%) lymphocytes before chemotherapy (according to the Kaplan–Meier method).

Note: ^o– Complete: (a) n=24, (b) n=13; ⁺– Censored: (a) n=26, (b) n=29

Рис. 2. Взаимосвязь безрецидивной (a) и общей (b) выживаемости больных ТН РМЖ с количеством CD25+ лимфоцитов (CD25+ %) периферической крови до начала химиотерапии (по методу Каплана– Мейера).

Примечание: ^о– нецензурированные данные: (a) n=23, (b) n=12;

+– цензурированные данные (больные с безрецидивным течением заболевания или живые пациентки на момент анализа): (a) n=24, (b) n=27

Fig. 2. The relationship between the three-year relapse-free (a)/overall (b) survival of breast cancer patients and the number of CD25⁺ (CD25⁺ %) lymphocytes before chemotherapy (according to the Kaplan–Meier method). Note: ^o– Complete: (a) n=23, (b) n=12; ⁺– Censored: (a) n=24, (b) n=27

Рис. 3. Взаимосвязь безрецидивной (a) и общей (b) выживаемости больных ТН РМЖ с количеством NKT- и CD25⁺ (NKT%& CD25⁺ %) лимфоцитов периферической крови до начала химиотерапии (по методу Каплана–Мейера). Период наблюдения – 66,9 мес. Примечание: ^о– нецензурированные данные: (a) n=9, (b) n=5; ⁺– цензурированные данные (больные с безрецидивным течением заболевания или живые пациентки на момент анализа): (a) n=23, (b) n=27 Fig. 3. The relationship between the three-year relapse-free (a) overall (b) survival of breast cancer patients and the number of NKT- and CD25⁺ (NKT%&CD25⁺%) lymphocytes before chemotherapy (according to the Kaplan–Meier method).

Note: ^o– Complete: (a) n=9, (b) n=5;

⁺– Censored: (a) n=23, (b) n=27

Обсуждение

NKT-клетки врожденного иммунитета составляют небольшую часть лимфоцитов, однако они способны эффективно уничтожать опухолевые клетки. В настоящее время выделяют три типа NKT-клеток: тип I NKT (iNKT), тип II NKT и NKT-подобные клетки. Наивысшую противоопухолевую активность проявляют iNKT-клетки, которые повреждают опухоль как с помощью прямого цитотоксического действия, так и непрямого путем секреции различных цитокинов, активирующих противоопухолевые механизмы, а также активизации истощенных CD8+ Т- и NK-клеток [12]. Снижение количества iNKT в ПК было обнаружено при различных злокачественных новообразованиях [13]. Выраженный дефицит iNKT- клеток ПК ассоциировался с неблагоприятным клиническим исходом у больных раком головы и шеи [14], а восстановление количества периферических iNKT-клеток обеспечивало длительную ремиссию у детей с различными гемобластозами [15]. В настоящем исследовании популяция NKT-клеток определялась по экспрессии наиболее часто используемых при исследовании этих лимфоцитов маркеров: CD3, CD16 и CD56 (CD3+CD16+CD56+), что не позволяет определить, к какому типу относятся эти клетки. Было обнаружено, что повышение процента (CD3+CD16+CD56+) NKT-клеток до лечения у части больных ТН РМЖ явилось благоприятным фактором и ассоциировалось с увеличением БРВ, по сравнению с больными, у которых этот показатель был снижен. Исходный уровень этих клеток, вероятно, не имел значимого влияния на ОВ. У пациенток, у которых до лечения количество CD25+ лимфоцитов было ниже контроля, и БРВ, и ОВ были статистически значимо снижены по сравнению с больными, у которых число этих